蛋白质相互作用

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1、蛋白质相互作用的概述一、为什么要研究蛋白质相互作用二、蛋白质相互作用亲和力：Kd=AB/AB三、蛋白质相互作用的应用A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库B、利用已知的相互作用建立tag： GST pull down，BiotinAvidin结合C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display, Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能I、一些常用蛋白质相互作用技术 Traditional co-purifica

2、tion (chromatography co-purification and co-sedimentation) Affinity chromatography： GST pull down，Epitope-tag (co-)Immunoprecipitation Western 和 Far-Western blotSurface Plasmon ResonanceTwo-Hybrid SystemFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)(实验过程及原理，注意事项，优缺点)III、研究实例讨论一、酵母双杂交系统作用：发现新的相互作用蛋白质；

3、鉴定和分析巳有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团具体过程：见书本优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA,简单；弱的相互作用也能检测到缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于 报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，

4、反之则两者之 间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂 交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。（1）原理：将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编 码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用， 则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可 通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相

5、互作用。应用范围1）巳知蛋白之间相互作用的检测：2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨 基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵表达质粒，将某一器官或组织的CDNA文库与AD基因构建成“猎 物基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的CDNA序列，并推测其蛋白质序列。1）二、噬茵体展示技术2）3）在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上 若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬

6、菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量 及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等 优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，巳经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的CDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中 的信号分子。4）5）三、等离子共振技术6）7）表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance，SPR）已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸 附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两

7、种蛋白的结合情况。SPR技术的优点 是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。8）9）四、荧光能量转移技术10）（fluorescence resonance energy transfer， FRET）FRET：优点：体内测定两个蛋白质之间的相互作用；敏感度高；溶解度好；大分子的主要构象变化能测定；定量和定性测定相互作用。缺点：只能测定荧光基团大小为（20-100）的分子；仪器设备很贵；需要荧光标记FRET可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用。基本原理：在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体Dono

8、r）的发射光谱与另一个基团（受体Acceptor）的吸收光谱有一 定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100 A），就可观察到荧光能量由供体向受体共振转移的现象，即以前一种基团 的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。其中以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）及其突变体的应用最为广泛。特点：a反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程;b两个荧光集团间的合适距离为20-100 A （2- 10nm） ;c需用荧光或GFP标记测试蛋白。荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用；与荧光显微

9、镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、 DNA和RNA的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定 量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。 该方法简单快速，可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP的供体受体对。FRET就是采用非放射方法，在供体和受体相互靠得很近（1-10 nm）时，将光子能从一个受激发的荧光团（供体）转移到另一个荧光 团（受体九当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基

10、团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP 的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间 位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建一融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成： CFP （cyan fluorescent protein）、蛋白质 b、YFP（yellow fluorescent protein）。用 CFP 吸收波长 433nm 作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋 白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而

11、检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但 当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检 测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光（图1）。将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞 生理条件下研究蛋白质一蛋白质间的相互作用。五、抗体与蛋白质阵列技术蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变， 微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上巳经日益

12、成熟。这些 抗体芯片有的巳经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多巳经应用再眼就的各个领域里。六、免疫共沉淀技术免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加 入与抗体特 异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA），若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一 种复合物：“目的蛋白一兴趣蛋白一抗兴趣蛋白抗体一SPA|Pansobin”，因为SPA|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western b

13、lotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种 方法得到的目的蛋白是在细 胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。（1）原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X， 那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档缺点：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择 最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本

14、身具有冒险性三是可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相 互作用七、pull-down 技术蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co- IP）、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、巳标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞 裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定巳知的蛋白与钓出蛋白或巳纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外 传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。1）原理细菌表达的谷胱甘肽s 一转移酶（

15、GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋 白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体 干扰蛋白质一蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。两种应用：1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用2）证实探针蛋白与巳知蛋白质间可疑的相互作用生物学意义是一切：1）通过改变蛋白质的相互作用，分析由蛋白质相互作用改变而产生的生物学现象。如通过酵母双杂交或蛋白质组分析，发现相互作用蛋 白质，再分析这些作用的生物学意义

16、。人们容易犯的错误是：研究一大堆的蛋白相互作用，却不知道这些相互作用有什么生物学意义。2）通过改变生物学现象，分析其中相关的蛋白质以及相互作用。如小分子化合物抑制了某一生物学活动，发现相应变化的蛋白质，再分 析蛋白质的功能和作用。人们容易犯的错误是：找到了平行变化的不相关蛋白质。蛋白质相互作用的亲和力是技术的基础。Kd=AB/AB。Kd越小，亲和力越好。抗体的亲和力为10-8-10-10 M是好,10-6M是弱蛋白质相互作用的应用：发现新的相互作用和相互作用蛋白利用抗原和抗体的相互作用的技术：1）Westrern blot:变性抗原，主要用于检测蛋白的存在与否2）免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴

17、定不同蛋白质间的相互作用Ab-Pr1-Pr2：免疫共沉淀。Pr1-Ab-Pr2：非特异性结合3）染色质沉淀：用抗体沉淀抗原得到与抗原结合的DNA，用PCR鉴定DNA，从而证明蛋白质和特定DNA间的相互作用。4）过时的抗体筛选：cDNA表达库，抗体结合表达的蛋白质，从而得到基因。有了质谱和PCR后过时。利用已知的相互作用建立tag：1）GST pull down :巳知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和巳知蛋白质结合的新蛋白质。GST tag2）Biotin-Avidin结合：生物素标记巳知蛋白质，通过Avidin结合生物素标记的蛋白质，从而得到与生物素

18、标记蛋白结合的新蛋白质。优点 是biotin-avidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。3）其它各种tag。例子生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子 生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。自20世纪70年代，BAS开始应用于免疫化学领域以来，利用BAS可 被荧光索、酶、放射性核素等材料标记的特点而发展和建立了许多新的检测方法和技术，尤其是与免疫标记技术的有机结合，极大地提高 了测定的灵敏度。直接利用蛋白质的相互作用：1）蛋白质亲和层

19、析：用蛋白质当亲和层析的亲和基团。要有大量的蛋白质2）酵母双杂交：优点是简单；缺点是不能得到修饰调控型的相互作用蛋白质。还有衍生的酵母三杂交以及单杂交。3）噬菌体展示：Physically固定蛋白质，结合phage，洗脱，扩增phage，再结合；循环4）快成化石的Bait蛋白质筛表达库：bait蛋白质用同位素、GST、等标记，再筛库。5）一网打尽的蛋白质组：这是检测和鉴定蛋白质的方法。由于检测和鉴定方法上的提高，使得许多蛋白质间的相互作用都可以被用于发 现新的蛋白质和新的相互作用。缺点是发现的相互作用蛋白质太多常常超出人们的辨别能力和研究能力。技术成果的鉴定：蛋白质相互作用的生物学功能是蛋白质

20、相互作用的意义1）相互作用的证实：不同的发现互相作用的技术都可以用来被验证相互作用的蛋白质。如GST pull down发现的蛋白质，用免疫共沉淀或 酵母双杂交验证。越接近生理状态的证实越好。验证方法和发现方法的差别越大验证结果也越可靠。采用的方法多，结果也越可靠。2) 相互作用的生物学功能：有重要生物学功能的相互作用、一般功能的相互作用、还是没有功能的相互作用。有运气的成分。如果从重 要功能蛋白质出发，从重要生物学现象出发，“运气”会越好。生物学功能的研究：技术成果的大小相互作用的生物学功能研究基本上可以归为两类：获得功能或失去功能。获得功能：转基因表达，使得原本不表达该蛋白质的细胞表达了蛋

21、白质，从而和巳有的蛋白质发生相互作用，细胞有新的功能。常用的方 法有细胞内转基因过表达蛋白质、转基因老鼠失去功能：抑制蛋白质的表达或用dominant negative突变体，使原有的蛋白质缺失或失活，细胞功能的丧失。常用的方法有：RNA干扰使 蛋白质不表达、蛋白质部分功能片断的影响、基因敲除的细胞、基因敲除的老鼠。一、一些常用蛋白质相互作用技术：蛋白质相互作用的亲和力是技术的基础。Kd=AB/AB。Kd越小，亲和力越好。抗体的亲和力为10-8-10-10 M是好,10-6M是弱。1、蛋白质相互作用的目的是发现蛋白质与蛋白质的相互作用：生化方法(co-purification 提纯，亲和色谱法

22、，GST pull down ,IP，WB, Far-Western)Surface plasmon resonance 表面等离子体谐振、遗传分析、酵母双杂交、Fluorescence resonance energy transfer： FRET 荧光共振能量转移、2、注释：表面等离子体谐振(Surface Plasmon Resonance,SPR)生化分析仪，是基于物理光学现象和生物传感技术的新型生化分析系统。荧光共振能量转移(FPET)：当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散发能量来返回到基态1-3。光能可被生色团在10-15秒内吸 收而在10-9秒内在发射出来。然而，也有可能

23、被激发分子并不发光而将能量传递给别的生色团或是另外的荧光素，这些荧光素可以在相同 的时间量级内发荧光，这后一种现象称为FPET.应用：是比较分子间距离与分子直径的有效工具，广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，可以定量测量两个发光基团之间的 距离，在蛋白质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋白间相互作用得到广泛应用。3、生化方法的具体实验：1) GST pull down ,见 ppt252) IP和CoIP：上网查3) Far-Western:a.不是用抗体直接与膜上的蛋白质结合，而是用另一个蛋白质通过相互作用与膜上蛋白质作用。b.直接标记另一个蛋白质或用抗另一个蛋 白质的抗体做

24、Western blot。c.因为是蛋白质相互作用，Far-Western常常会包含一步蛋白质复性的过程。4) SPR：用来监控生物特定表面在金属层的相互作用，通过测量这个相互作用引起的溶液浓度的变化。具体过程BLAcore SPR的优点：不用标记；实时测量4、遗传方法:例子：有A：小量表达；有B：无表达；有C：无表达有A和B：表达增加；有A和C：小量表达；有B和C：无表达有A、B、C：高表达结论：在A、B和C的蛋白质复合体中，A是和基因调控区结合并有小的转录活性；B可以和A结合促进A的转录活性；C本身不能直接 促进A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通过B的介导进一步促进转录。O二

25、、研究实例讨论：1、G2/M期阻断的实验测定方法：根据DNA的含量变化2、亲和层吸：对磷酸化蛋白质有特异性的结合(PY蛋白)3、质谱鉴定蛋白4、磷酸化蛋白质的验证5、蛋白质生物学功能的验证：Loss of function and gain of function6、进一步寻找相互作用蛋白质7、细胞内的定位和细胞器，与细胞器的动态相互作用8、根据巳知的蛋白质结构和功能的特点，提出功能模型9、模型的验证10、得到研究结论1.2. 生化方法(Biochemical approaches)1.1 共纯化、共沉淀 Traditional co-purification (chromatography

26、co-purification and co-sedimentation)在不同基质上进行色谱层析1.2蛋白质亲和层析(Affinity chromatography)将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过改基质时，可与改固 定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回 收下来。GST pull down：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化 的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GS

27、H的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过 柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。Epitope-tag：表位附加标记技术 就是将附加的抗原融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的 蛋白。缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果 还应经其他方法验证。1.3 免疫共沉淀(Immunopre

28、cipitation)免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白 的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。Pmtsiii comptoxProtein compiercaptureAntibody captureDigest,LC-MS-MSIdentify components1.4 Far-Western又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜

29、上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。3. 表面等离子共振 (Surface plasmon resonance)该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱 饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓 度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。芯片比较昂贵，如果重复使用可能导致结果不好。4.

30、 遗传学方法(Genetic approaches)基因外抑制子基因外抑制子是通过一个基因的突变来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B，如果A发生了突变使两者不再相互作用， 此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复，那么B就是A的基因外抑制子。缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑制子比较费时。合成致死筛选指两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。5. 酵母双杂交(Two-hybrid)原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同

31、诱饵 蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激 活报告基因。优点是是酵母细胞内的in viv相互作用，只需要cDNA，简单，弱的相互作用也能检测到。缺点：自身有转录功能的蛋白或者有其他蛋白插足介导或者自身激活报告基因会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能； 不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。另外还有酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰；对基因库的要求比较高，单向 1/3是in frame；蛋白质毒性等。6. 荧光共振能量转移技术 (Fluorescence resonance energy

32、transfer)指两个荧光法色基团在足够近(100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激 发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量 的检测相互作用的强度。缺点：此项技术要求发色基团的距离100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。此外还有交联技术(crosslinKing)，蛋白质探针技术，噬菌体展示技术(Phage display)以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相Co-fransformotionExpiessionof DB-Xand AD-Y or

33、otslris使得待研究蛋白可融合表达互作用。I酵母双杂交2.2.1构建pBD-A与pAD-I两种重组表达质粒，这样GAL4 DNA结合结构域和GAL4激活结构域；2.2.2 pBD-A与pAD-I两种质粒共转化酵母细胞。分别设置如下对照组：pBD/pAD；pBD-A / pAD； pBD / pAD-I；2.2.3蓝白斑法验证LacZ基因的表达情况。说明:如果蛋白A和蛋白I能够相互作用，那么GAL4 DNA结合结构域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活lacZ报道基因的表达。如果设置的实验组长出蓝色克隆而对照组没有的话基本上可证明蛋白A和蛋白I有相互作用。inleractTramcrl

34、plfaeiProm aterorler概述3）研究蛋白质相互作用的意义：细胞生命活动的基础稳定相互作用-protein complex瞬时相互作用-enzyme-substrate蛋白质相互作用如无相应功能是没有研究意义的！蛋白质相互作用=-一-了-二=生物学功能4）蛋白质相互作用的亲和力-一切蛋白质相互作用的基础AB = A+B Kd=AB/AB （ Kd: dissociation constant ）5）蛋白质相互作用的应用1、利用抗原和抗体的相互作用Western blot :变性抗原，主要用于检测蛋白质的存在与否。免疫共沉淀：非变性抗原，用于鉴定不同蛋白质间的相互作用。Ab-Pr1

35、-Pr2：免疫共沉淀Pr1-Ab-Pr2：非特异性结合染色质沉淀：用抗体沉淀抗原得到与抗原结合的DNA，用PCR鉴定DNA，从而证明蛋白质和特定DNA间的相互作用2、利用巳知的相互作用建立tagGST pull down： 已知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和巳知蛋白质结合的新蛋白质，即 GST tag。BiotinAvidin结合：Biotin标记巳知蛋白质，通过Avidin结合biotin标记的蛋白质，从而得到与biotin标记蛋白结合的新蛋白质。优 点是biotin avidin的结合是最牢靠的；缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多。3、直

36、接利用蛋白质的相互作用蛋白质亲和层析：用蛋白质当亲和层析的亲和基团。要有大量的蛋白质。酵母双杂交：优点是简单；缺点是不能得到修饰调控型的相互作用蛋白质。还有衍生的酵母三杂交以及单杂交。phage display： Physically固定蛋白质，结合phage，洗脱，扩增phage,再结合；这样做好几轮。Bait蛋白质筛表达库：bait蛋白质用同位素、GST、等标记，再筛库。蛋白质组：这是检测和鉴定蛋白质的方法。不管用什么方法，只要你能得到结合的蛋白质，理论上蛋白质组都可以分析。但由于检测 和鉴定方法上的提高，使得许多蛋白质间的相互作用都可以被用于发现新的蛋白质和新的相互作用。缺点是发现的相互

37、作用蛋白质太多常 常超出人们的辨别能力和研究能力。11）发现相互作用的生物学意义相互作用的证实：不同的发现相互作用的技术都可以被用来验证相互作用的蛋白质。相互作用的生物学功能：有重要生物学功能的相互作用、一般功能的相互作用、还是没有功能的相互作用。12）生物学功能的研究功能的获得：转基因表达，使得原本不表达该蛋白质的细胞表达了蛋白质，从而和巳有的蛋白质发生相互作用，细胞有了新的功能。 常用技术：细胞内转基因过表达蛋白质、转基因老鼠功能的失去：抑制蛋白质的表达或用dominant negative突变体，使原有的蛋白质缺失或失活，细胞功能的丧失。 常用技术：RNA干扰使蛋白质不表达、蛋白质部分功

38、能片断的影响、基因敲除的细胞、基因敲除的老鼠一些常用蛋白质相互作用技术5）生化方法Traditional co-purificationAffinity chromatography（GST pull down）ImmunoprecipitationWestern and Far-Western blota. GST pull down巳知蛋白质和GST融合，与细胞或组织的“蛋白质汤”混合，用谷胱甘肽亲和层析分离和巳知蛋白质结合的新蛋白质。GSTtag。GST （谷胱甘肽S转移酶）GST的结合较弱!b. 免疫共沉淀免疫沉淀：通过抗原与抗体的结合得到所要的蛋白质免疫共沉淀：通过抗原与抗体的结合，

39、得到与该巳知蛋白有相互作用的蛋白质优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用; 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。c. 蛋白质分析技术：SDS-PAGE：蛋白质按分子大小分离。Western Blot：显示特异蛋白质的技术。基本原理：采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳

40、，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（PVDF膜全面优于nitrocellulose膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持 电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。决定因素：SDS-PAGE acrylamide的浓度蛋白质上样的量相邻泳道的蛋白质量、离子强度和样品体积转移膜转移电流抗体注意点：1、电转移效率2、PV

41、DF膜的充分浸润3、转移液中有太多的SDS4、膜的损坏5、转移时胶和膜没有完全接触6、抗体的问题7、抗体的浓度太高或太低8、还原性物质的存在9、封闭不充分等电聚焦：蛋白质按PI值分离。非变性电泳：蛋白质按分子量和电荷的比值分离。可用来分离具有生物活性的蛋白质。d. Far western不是用抗体直接与膜上的蛋白质结合，而是用另一个蛋白质通过相互作用与膜上蛋白质作用。直接标记另一个蛋白质或用抗另一个蛋白质的抗体做Western blot。因为是蛋白质相互作用，FarWestern常常会包含一步蛋白质复性的过程。e. Surface plasmon resonance原理：表面等离子体谐振(SP

42、R)利用SPR传感器通过检测共振角或共振波长的变化来检测待测分子的成分，浓度及参与化学反应的特性。生物检测上，主要用于检测生物分子的结合作用或者通过生物分子结合作用的检测来完成特定生物分子的识别及其浓度的测定。优点：lable-free detectionReal time measurement特点：SPR技术因其高效灵敏无需额外标记等优势，广泛应用与蛋白质检测和蛋白-蛋白相互作用等蛋白质组学研究，它能在保持蛋白质天 然状态的情况下实时提供靶蛋白的细胞器分布，结合动力学及浓度变化等功能信息，为蛋白质组研究开辟了全新模式。f. Two-hybrid system(酵 母双杂交)典型的真核生长转

43、录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)(BD)和转录激活结构域 (transcription-activating domain)(AD)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构 域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。因此当在DB上连接X蛋白，AD上连接Y蛋白时，若X与Y有相互作用，则同样可以激活lacZ的表达。因此，通过酵母双杂交可以发现新的相互作用的蛋白质，如X，Y。lacZ作为reporter gene，用蓝白筛选的方法检测。Two-Hybrid 的优点：是酵母细胞内的in vivo相互作用。只需要cDNA，简单。弱的相互作用也能检测到。Two-Hybrid 的缺点:都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用。酵母的翻译后修饰不尽相同。尤其是蛋白质的调控性修饰。自身激活报告基因。都基因库的要求比较高，单向1/3是in frame蛋白质毒性。第三者Z插足介导的相互作用。假阳性。