LFY类基因在茎端分生组织形成中的作用

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1、LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用Expression Pattern of LFY-like Gene and its Function in Shoot Apical Meristem Activity98级生命科学学院 细胞生物与遗传学系 刘曼摘 要 LFY类基因在植物形态建成过程中具有重要作用，根据其突变体的特性，曾一度被觉得是在花分生组织和花序分生组织中特异体现的“分生组织特性决定基因”，控制花序分生组织向花分生组织的转变。但随着研究的进一步，人们发现其在营养分生组织甚至胚胎发生过程中均有所体现。本实验试图通过启动子活动特点研究、mRNA水平上原位杂交分析等多种措施，对其

2、功能进行进一步地探讨，以期全面地结识该类基因在植物发育中的作用。Abstract LFY-like genes play important role in plant development, when they were first isolated from mutants of Antirrhinum and Arabidopsis, they were thought to be “SAM-specific-determinating-genes”, regulating the transition from inflorescence to flower meristem. Ho

3、wever, further research revealed that LFY-like genes activity can be found in embryogenesis, shoot apices and axillary buds at different stages as well as in flower primordial. We characterized LFY promoters activity and investigated LFY mRNA expression with Whole-mount in situ Hybridization, in ord

4、er to make their function clearer. 引言 植物形态建成有与动物形态建成完全不同的特点：其完毕生活周期所需的地上部分基本器官类型都是由茎端分生组织（shoot apical meristem, SAM）的活动而逐渐形成的。因此，茎端分生组织在植物形态建成中的重要性是不言而喻的。但长期以来，虽然人们始终在努力，并且近十年来浮现了分离得到茎端分生组织活动有关基因等重大的突破1，可目前在茎端分生组织的形成变化及其终结方式等基本问题方面却仍然没有得到合乎逻辑的解释。根据突变体研究的初期成果，人们形成了目前占主导地位的观点，即茎端分生组织在“胚胎发生”过程中形成，随后在“

5、胚后发生”的过程中，被某些“分生组织特性决定基因”控制，逐渐由“营养分生组织”变化为“花序分生组织”和“花分生组织”2。但随着研究的进一步，人们逐渐发现，某些过去被觉得是在“花分生组织”和“花序分生组织”中特异体现的“分生组织特性决定基因”，大部分都不用限度地在“营养分生组织”甚至“胚胎发生”过程中体现3-7。这些现象是既有的假说所无法解释的。显然，这些新的发现对既有的观点提出了不可回避的挑战。只有通过对这些基因体现特性及其功能的进一步研究，我们才有也许真正从分子水平上逐渐解释茎端分生组织形成、活动及其终结的分子机理并从中逐渐揭示茎端分生组织在植物形态建成中所扮演的角色。 LFY类基因正是上述

6、基因中的一种。它的突变导致植物表型发生一系列的变化。在野生型植物体中应发育成花的部位，在lfy突变体中则发育出花序，或是仅由萼片和花瓣构成的异常花。并且LFY和APETALA1或APETALA2的双重突变体会导致植物的花完全丧失野生型花所具有的缩短节间、顶端有限生长等特点。根据以上种种现象，当LFY类基因从金鱼草和拟南芥的有关突变体中分离出来时，被觉得其在植物发育中控制茎端分生组织从花序分生组织转变为花分生组织2，8。但随着该基因的同源序列从其她植物中被陆续分离，人们发目前烟草、凤仙花、豌豆、矮牵牛、水稻、松树等植物中，LFY类基因的体现并不局限于花分生组织，而是广泛地存在于不同发育阶段的茎端

7、分生组织3-6，9，10。更重要的是，后来的研究表白，虽然在拟南芥中，LFY基因事实上在其初期的发育阶段，即在花序分生组织形成之前，已经在茎端分生组织中体现11。同步，转基因实验表白，LFY基因体现量越大，植物开花越早12，13。因此，对该基因的功能又有了一种新的结识，即它不仅决定花序分生组织转变为花分生组织，并且还影响开花的早晚。 白书农专家等在进行另一种拟南芥突变体emf的研究中，曾注意到LFY基因在植物初期发育阶段体现中的特点，并曾运用LFY:GUS转基因植物为材料，对其在植株“营养生长”阶段的体现特点进行过系统的研究白书农等，未刊登资料，1998。发现LFY基因的启动子不仅在种子萌发后

8、不同阶段的茎端分生组织和幼小的器官原基中体现，并且在初期胚胎发生过程中也有体现。最为引人注目的是，LFY基因启动子的活动与由根外植体再生植株过程中茎端分生组织的形成及其活动存在直接的有关。据此白书农专家等提出，LFY基因的体现很也许与茎端分生组织的形成及其活动有关，而它体现量的增长水平和开花有关联。 但是，有研究表白，以GUS等报告基因所显示的启动子活动模式也许并不一定反映该启动子对其原有基因体现的时空调节模式。由于基因的体现不单需要启动子的活动，还和某些其她因子，例如内含子等有关。因此，要真正理解LFY基因在分生组织形成与活动过程中的体现特点，还应有对其转录产物即mRNA进行原位检测的证据。

9、本课题即是在本实验室过去工作的基本上，试图从正常植株与组培过程再生植株中LFY启动子活动方式的检测和LFY基因转录产物的直接检测两个方面，对LFY类基因初期体现特点及其也许的功能等核心问题进行进一步地探讨。本课题研究中重要波及两种基因体现的检测技术。当研究LFY启动子活动方式时，我们采用报告基因的体现分析措施。报告基因一般编码一种在离体条件下易于检测的酶，或者编码可以在活体条件下进行组织化学定位的蛋白，这样就可以提供基因体现定量的和定性的信息。gusA基因是从大肠杆菌（Escherichia coli）中分离出来的，并且目前有某些基因盒可以容许在gusA基因的附近插入启动子区，产生转录融合基因

10、或翻译融合基因。我们实验所用的Plfy:GUS拟南芥和Plfy:GUS烟草、Pnfl:GUS烟草即是在gusA基因前插入LFY或NFL基因的启动子（Plfy或Pnfl），当Plfy或Pnfl活动时，带动gusA体现，运用一种简朴的组织化学检测就可以精确地分析gusA融合基因的时空体现模式。用5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸（X-gluc）作为底物可以精确地进行GUS活性的定位，这一反映分两步进行：一方面是切割葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。用GUS进行此类实验有如下长处：（1）在大多数植物组织中GUS活性的本底低；（2）反映产物不扩散，在体

11、现基因的植物细胞内积累；（3）通过简朴的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸取。固然，也存在某些缺陷：（1）组织化学染色后植物失去继续培养的也许，这样不能跟踪检测同一株植物不同步期的基因活动状况；（2）由于酶和产物非常稳定，因而不能真实的反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；（3）人们发目前GUS体现水平很高的组织中会发生无色反映中间产物渗漏的现象，但是，这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾或者两者都加（终浓度为5mmol/L），来使这种渗漏减至至少（Stomp 1990; Masarenhas和Hamilton 1992）；（4）同所有的组织化学措施同样，其检测成果不

12、是定量的。并且，最致命的缺陷是，启动子的分析不一定总能反映基因的真实活动状况（如前文所述），这是在运用报告基因措施进行基因体现特性分析时必须注意的一种问题。当检测LFY基因的转录产物时，我们用到了原位杂交 （in situ Hybridization, 简称ISH）技术。该技术最早是由Gall和Pardue (1 969)及John等 (1 969)独立发明的。其基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则 （A-T, C-G）,将有放射性或非放射性标记的外源核酸 (探针：Probe )与染色体上通过变性后的单链DNA互补配对 ,结合成专一的核酸杂交分子 ,再经一定的检测手段 ,将待测核酸在染色体

13、上的位置显示出来。我们采用的mRNA水平的原位杂交技术，是将具有目的基因cDNA的质粒分别用限制性内切酶从目的片断的两端单切，使质粒线性化。然后从两端用不同的转录酶按照A-U, C-G的互补配对原则合成一段RNA片断，其中UTP上标记地高辛，这标记上的RNA片断即为探针。当目的基因体现时，mRNA能和反义探针特异性结合，在底物的作用下显色。而正义探针为负对照。由于 RNA原位杂交技术可以精确拟定基因体现的时空分布，而植物基因的时空体现研究是探讨植物生长发育机制的重要手段，因此在以研究植物发育机制为主的本实验室，原位杂交成为一项重要的并十分核心的技术。 目前植物研究中，原位杂交得到了越来越广泛的

14、应用，重要有 3种措施 :一是常规组织切片RNA原位杂交，广泛合用于多种组织 ;二是大量细胞的整体RNA原位杂交 ,已应用于花粉管和藻类合子;三是微量细胞的整体RNA原位杂交 ,用于分离胚囊。我所使用的整体原位杂交技术，是一种较新的组织RNA原位杂交措施。该措施的实验材料是具有完整形态构造的植物器官或其组合，如花、花序等。该技术可以直接从整体构造上观测到基因体现的空间特性，具有易操作、周期短等特点，并避免了一般在切片上原位杂交所需的三维重构环节。材料和措施1 实验材料1.1 植物材料野生型拟南芥种子（Columbia）Plfy:GUS转基因拟南芥种子（由Detlef Weigel提供）野生型烟

15、草种子（Nicotiana tabacun var. Wisconsin 38）Plfy:GUS转基因烟草种子（由本实验室毕业博士生刘复权构建、提供）1.2 菌种和质粒大肠杆菌DH5质粒：Pnfl:GFP (Kan R )Plfy:antiLFY(Kan R )PDW124-LFY (Amp R )以上质粒均由本实验室已毕业博士生刘复权构建，本实验室保存。 1.3 分子生物学和生化试剂多种限制性内切酶购自TaKaRa 公司，PCR试剂购自鼎国生物公司，原位杂交地高辛标记RNA探针试剂盒及杂交液（DIG easy Hyb）购自Roche生物公司，多种激素和抗生素以及x-Gluc购自北京经科生物工

16、程公司，其她试剂均为国产分析纯。1.4 PCR引物 以GFP基由于模板的PCR引物由本人设计，上海生工生物工程公司合成。 5GFP (21bp):5-GGT GAA GGT GAT GCA ACA TAC-3 3GFP (18bp):5-GAA AGG GCA GAT TGT GTG-3 1.5 x-Gluc 染色液(1mL) N、N二甲基甲酰胺 50uL x-Gluc 0.5mg 100mM 磷酸缓冲液 pH7.0 980uL 5mM 铁氰化钾 10uL 5mM 亚铁氰化钾 10uL Triton x-100 1uL 1.6 植物叶绿素透明液 乙醇：乙酸=9：1 1.7 培养基 1.7.1

17、拟南芥、烟草组织培养基 MS (含3%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.8)愈伤组织诱导培养基（Callus-Inducing Medium, CIM）: B5+0.5mg/L 2,4-D + 0.05mg/L KIN (含2%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.5)生芽培养基（Shoot-Inducing Medium, SIM）: B5+0.15mg/L IAA + 5mg/L2ip (含2%的蔗糖和0.75%的琼脂，调pH=5.5) 1.7.2 细菌培养基 LB培养基：每升培养基含5克酵母提取物，10克蛋白胨，10克氯化钠，pH=7.5，固体培养基含1%琼脂 1.8 原位杂交所需试

18、剂 PBS: 0.13M NaCl, 0.007M Na2HPO4 ,0.003M NaH2 PO4 , 0.27mM KCl, pH 7.4 PBT: PBS+0.1% Tween 20 固定液 (FB): PBT+0.08M EGTA, 5%多聚甲醛, 10% DMSO (pH 7.4) NTE: 500mM NaCl, 10mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM EDTA 封阻液 (BS): PBT+ 2% BSA 渗入液 (SB): 100mM NaCl, 50mM MgCl2 , 100mM Tris-HCl (pH9.5), 0.1% Tween 20 停止渗入液 (SS

19、B): PBT+20mM EDTA 2 重要措施2.1 质粒载体构建部分2.1.1 原质粒的酶切将Plfy:antiLFY，Pnfl:GFP用XbaI和SacI双切，得到Plfy-载体和GFP片断。2.1.2 从凝胶中分离纯化DNA片段(1) 切下具有DNA片段的胶块，转移到1.5 ml 离心管中, 于70温育直至胶完全融化. 加1 ml 树脂(resin), 混合20秒.(2) 去掉注射器上的推动器，将Minicolumn安上。(3) 将树脂/DNA混合液移入注射管中，慢慢插入推动器，轻轻将悬浮液推动Minicolumn中。(4) 从Minicolumn去掉注射器，取出推动器。再安注射管于M

20、inicolumn上。加2m1的80%异丙醇于注射管中洗Minicolumn。插入推动器，缓慢将异丙醇推过Minicolumn。(5) 去掉注射器，将Minicolumn放在1.5ml离心管中，离心2分钟，使树脂/DNA干燥。(6) 将Minicolumn移入一种新的离心管，加50ul水或TE，放置1分钟，离心20秒，溶下DNA片段。(7) 仍掉Minicolumn.纯化的DNA储藏于4或-20。2.1.3 连接在冰上建立如下连接体系: 2*T4 DNA连接酶Buffer 5uL Plfy-载体 1uL GFP 3uL T4 DNA连接酶 1uL轻轻混匀后，4连接过夜。 2.1.4 大肠杆菌D

21、H5感受态细胞的制备(1) 从LB平板上挑取E.coli DH5单菌落接种于2mL LB液体培养基中，37振荡培养过夜，取100-200uL菌液于2mL LB中，37振荡培养2-3小时后所有转入100LB中，37振荡培养2-3小时至对数生长期(OD600=0.4左右)。 (2) 无菌条件下转入1.5mL Eppendorf，冰浴10min。(3) 4 4000rpm 8min，回收细胞。(4) 用400uL冰预冷的CaCl2 (0.1M)重悬沉淀，置于冰上15-30min。(5) 4 4000rpm 8min，回收细胞。(6) 用100uL冰预冷的CaCl2 (0.1M)重悬沉淀，备用。 2.

22、1.5 转化(1) 100uL感受态细胞中加入1.5uL质粒，轻轻旋转，混匀内容物，冰上 置30min。 (2) 42水浴90s，不要摆动试管。 (3) 迅速将试管转移至冰上，冷却2min。 (4) 每管加入200uL LB，37振荡45min1hr。 (5) 涂板(Kan)。 (6) 至液体完全吸取后，倒置平板，37培养。 2.1.6 提质粒 用小量碱法提取质粒：(1) 取1.5mL菌液转移至Eppendorf管，于4，1rpm离心30”。(2)吸去上清，空气干燥沉淀。沉淀悬浮于100ul溶液中（25mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTA, 50mM葡萄糖）中，振荡混匀室温

23、放置5分钟。(3)如果200ul溶液（0.2M NaOH, 1%SDS），放冰浴中5分钟。(4)再加入150ul溶液（3M NaAc, pH4.8），放冰浴中5-10分钟，1rpm 4离心5分钟。取上清加等量酚：氯仿，振荡，4，1rpm 2分钟。(5)取上清加2倍体积乙醇，振荡，置2分钟。(6)4，1rpm 2分钟，吸去上清，沥干。(7)加1mL 70%乙醇洗涤2次。(8)用50ul TE溶解（加入1ul Rnase）。 2.1.7 酶切鉴定及PCR鉴定 所用限制性内切酶及PCR引物如前2.1.1及1.4所述。 2.2 GUS活性的组织化学定位部分 2.2.1 组织培养(1)将植物长出两周的主

24、根切下成5-10mm的小段，转移至CIM中诱导其长愈伤。(2)三周后，将愈伤组织转移至SIM中诱导其长芽。(3)设未转基因植物作负对照，对照和解决之间的培养条件要完全一致。(4)不管在CIM中还是在SIM中，培养基要每1-2周续代一次，及时更新。(5)注意大量培养，在由CIM转移至SIM的同步，应保存一部分材料作CIM续代，以此作为SIM培养下的解决的另一种对照。(6)实验过程中特别要注意无菌操作！ 2.2.2 GUS活性检测(1)当植物的根在CIM中培养时，每隔2-3天作一次GUS组织化学染色进行跟踪监测。(2)当愈伤组织在SIM中培养时，每隔一周左右作一次检测。等到长出再生芽和再生根时，切

25、下芽和根分别作检测。(3)未转基因的对照必须和解决始终同步进行。(4)设立反复，至少3-5次。(5)具体措施：a. 无菌操作，将要检测的植物部位小心切下来，转入GUS染液，使材料和染液的体积比1:5。b. 真空解决2-10分钟。c. 放入37恒温箱中温育12-16小时。d. 待GUS渗入材料中后，材料转入透明液中透明，放置于室温下3小时。 2.2.3观测和照像 经透明解决后的植物材料在Motic 解剖镜下观测，有GUS体现的部位显 现稳定、不溶于透明液的蓝色。解剖镜上接理光XR-X 相机照相， 相片通过Acer ScanPrisa 640U型扫描仪输入电脑，由Adobe Photoshop 6

26、.0 作合适解决。2.3 整体原位杂交2.3.1 探针标记 限制性内切酶消化质粒LFY：antisense BamH1Sense KpnI(1)37C 消化2小时，电泳检查线性化与否完全；(2)加等体积酚-氯仿，混匀；(3)1转离心10分钟，收集上清，(4)加2倍体积无水乙醇（预冷），混匀，-20C，30分钟；(5)1转离心10分钟，弃上清，(6)加70%乙醇（预冷），弃上清，(7)真空干燥，沉淀溶于10微升无菌水中；(8)电泳检测。体外转录(1)每个反映体系内含：模板4微升，5*缓冲液4微升，DTT2微升，RNA Block 1uL，5*NTP 4微升，Polymerase 2微升，DEPC

27、-H2O 3微升。37C 2小时。LFY： antisense T3Sense T7(2)Dnase I 于37C解决15分钟以除去模板，每个体系加 2.5微升的3M NaAc和75微升的预冷的无水乙醇，-20C 过夜，(3)4C 下离心15分钟，13000转；(4)70%预冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升DEPC-treated H2O。碱性水解(1)50微升探针加50微升碳酸缓冲液，60C 水解，LFY45分钟， 每管加10微升5%乙酸，置冰上；(2)每管加11微升的3MnaAc，200微升预冷无水乙醇，-20C 过夜；(3)4C 下离心15分钟，1转；(4)70%预冷的乙醇沉淀一次，

28、吹干后溶于50微升甲酰胺。2.3.2 原位杂交(1)固定FB 30min甲醇 2次 5min乙醇 4次 5min(2)杂交预解决乙醇 2次 2min1:1 乙醇:二甲苯 30min乙醇 2次 5min甲醇 2次 5min1:1 甲醇:PBT 10minPBT+5%甲醛 30minPBT 3次 2minPBT+40ug/mL 蛋白酶K 10-15minPBT+0.2% 甘氨酸 5minPBT 2次 2minPBT+5% 甲醛 30minPBT 4次 2min1:1 PBT:HS 10minHS 2次 2min预杂交 2hr 60(3)杂交400uL HS + 3uL RNA probe + sa

29、lmon tests DNA (100ug/mL)（探针和salmon tests DNA预先85变性5min）16-20hr 60(4)杂交后解决HS 2次 30min 551:1 HS:NTE 60minNTE 60minNTE 2minNTE+40ug/mL Rnase A 45min 37NTE 15min 37NTE 5次 15min1:1 NTE:PBT 20minPBT 2minBS 至少30min(5)检测anti-DIG抗体解决a. 等量混合固定后的和新鲜材料+少量冰冷90%丙酮，液氮中磨成细粉b. 加入更多90%丙酮，使劲混合均匀，4储存过夜c. 13,000g 5min离

30、心，弃上清。在少量90%丙酮中重悬沉淀，将沉淀分散于一滤纸上，风干d. 在30mg干粉中加入400uL BS和20uL anti-DIG Fab fragment，室温黑暗中24hre. 10,000离心3min信号检测BS 100uL中加入1uL e中上清，4过夜新鲜BS 10minPBT 4次 60minSB 2次 5min1mL中加入8uL Roche公司的nitro blue tetrazolium chloride + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate 5-60min黑暗中显色显色完毕后用SSB终结反映 (6)观测和照像用甘油:PBS 7:3

31、溶液封片，在OLYMPUS显微镜下观测并照像，相片通过Acer ScanPrisa 640U型扫描仪输入电脑，由Adobe Photoshop 6.0作合适解决。 实验成果1. 拟南芥中LFY启动子活动特点的验证 白书农专家等早年曾运用Plfy:GUS转基因拟南芥为材料，系统检测过在植物发育初期的SAM中和以根为外植体的植株再生过程中Plfy的活动特点。我一方面反复了该实验，以便熟悉各个环节和操作，同步也进一步验证该实验的可反复性。 实验措施如2.2中所述，成果见图1所示。早在幼苗长出的第二天，GUS活动就在SAM中体现出来（图1-A）。而在茎的其她部位、成熟的叶片和根中，没有Plfy的活动（

32、图1-B）。为了避免SAM中已存在的GUS活性干扰，本实验以无GUS活动的根为外植体进行植株再生。当将根移入CIM中诱导愈伤时，第二天就在成熟根外周区域有细胞分裂的地方发现了单薄的GUS体现（图1-D）。且随着愈伤的生长，GUS活性逐渐提高（图1-E至图1-J）。本实验的成果再次验证了在拟南芥中，Plfy在初期即定位体现于SAM中，且在根外植体再生过程中有Plfy的活动。由于植株再生过程中波及到SAM的重组，我们由以上两点推测Plfy的体现与SAM的形成与活动直接有关，但这个假设尚需进一步的实验成果验证。通过本实验，我纯熟掌握了植物组织培养、GUS组织化学染色解剖观测和照相等各项实验技能，为进

33、一步的工作打下了基本。2. LFY启动子在烟草中与在拟南芥中有相似的活动特点 为了验证Plfy在拟南芥中的上述体现特点与否具有普遍性，我又运用Plfy:GUS转基因烟草为材料，用与拟南芥同样的措施分析Plfy在初期SAM和根外植体植株再生过程中的活动特点。实验成果如图2所示。与拟南芥相似的是，转基因烟草的初期SAM（图2-A、2-B）和再生芽原基（图2-C、2-D、2-E）以及再生芽分生组织区域（图2-F、2-G、2-H）中均有明显的GUS体现，但转基因烟草也具有自己的特点，即在茎尖中所检测到的GUS染色水平与同步期的拟南芥相比偏低，并且用既有的措施，未能检测到初期愈伤中的GUS活动。 这个实

34、验证明，LFY基因在植物幼苗SAM和叶原基、芽原基中的体现特点是具有普遍性的。而烟草初期愈伤中未能如拟南芥那样检测到GUS反映活 性，估计也许由于Plfy在烟草中活动强度太低，但该推测尚需进一步的实验验证。3. RNA水平上的LFY体现特性与GUS检测成果相似考虑到既有的文献中所述现象，启动子的研究不能完全反映基因的真实体现状况（详见引言部分），要想清晰地研究其功能，我们必须直接检测该基因的转录产物。因此我试图用RNA水平整体原位杂交的措施，在拟南芥不同发育阶段SAM中和根外植体植株再生过程中对LFY基因的转录产物进行直接检测和定位。如果LFY基因的确在RNA水平上存在与启动子相似的体现特点，

35、则表白启动子分析成果是可靠和故意义的，从而进一步验证了我们有关LFY基因功能的假说。否则，则表白过去启动子分析的成果未能反映实际基因体现的状况。具体流程如实验措施中所述。一方面，要想获得好的原位杂交成果，先需要一种高质量的探针。我用BamHI和KpnI双切pDW124-LFY质粒，切出LFY基因，检测了该质粒的对的性。然后用BamHI和KpnI分别从两端单切，使质粒线性化。成果如图1.1所示。转录后成果见1.2，水解后成果见1.3所示。 图1：探针制备电泳图谱1.1: 质粒酶切图谱Lane 1: DL DNA Marker Lane 2: LFY/BamHI+KpnI ，小片段即为切出的LFY

36、基因 Lane 3: LFY/KpnI，已线性化完全 Lane 4: LFY/BamHI，已线性化完全 Lane 5: LFY质粒对照1. 2: 转录后电泳图谱（未经Dnase解决）Lane 1: LFY/KpnI （T7转录酶） Lane 2: LFY/BamHI（T3转录酶） Lane 3: Control 箭头所示为转录出的RNA条带1. 3: 水解后电泳图谱Lane 1: DL DNA Marker Lane 2: LFY/KpnI Lane 3: LFY/BamHI Lane 4: Control 箭头所示为水解后的RNA小片段 杂交成果见图版3。A-D显示的是拟南芥发育过程中的LF

37、Y基因体现状况。7天大小、14天大小的拟南芥幼苗以及花序中，LFY基因的体现定位于茎端分生组织和叶原基、花芽原基中，而在茎的其她部分、花梗、成熟的叶片中，检测不到LFY的体现信号。 同样以无LFY活动的根为外植体进行植株再生，现已检测到在CIM中培养4天的根外植体细胞分裂旺盛的部位中的LFY体现信号（图4-E、图4-F）。后续的检测工作正在进一步进行。 值得注意的是，用原位杂交和用GUS组织化学染色检测的成果显示，LFY的活动和LFY启动子的活动的确是一一相应的（至少既有的成果阐明了这一点），这初步证明了过去获得的Plfy活动成果具有一定的可靠性。4. Plfy:GFP载体的构建 在Plfy:

38、GUS拟南芥根外植体植株再生过程中，愈伤组织中可发现明显的GUS活动，至于有GUS活动的部位与否会出芽，目前还不得而知，由于组织化学染色将杀死细胞，失去继续培养、跟踪观测的也许。也就是说在茎端分生组织形成之前，我们观测到了LFY的活动；在茎端分生组织形成之后，我们又观测到了LFY基因的特异体现。但是茎端分生组织的这团细胞与否来自茎端分生组织形成前有LFY活动的细胞，目前还没有直接的证据。针对这一问题，我打算构建Plfy:GFP载体并将其转入拟南芥，从而能在荧光下跟踪检测Plfy的活动。如果Plfy活动部位和出芽部位确有一致性，则为我们的假设提供了一种有力的证据。 目前手头上已具有Plfy:an

39、tiLFY和Pnfl:GFP质粒，在antiLFY和GFP两侧均有XbaI和SacI的酶切位点，我用这两种限制性内切酶将这两种质粒切开，从琼脂糖凝胶上精确切下载体-Plfy片断和GFP片断，再将两者进行连接。 一方面，我用酶切的措施和PCR的措施检测了Plfy:antiLFY和Pnfl:GFP两个质粒的对的性。对于Plfy:antiLFY，Plfy是构建新载体需要的片段，antiLFY却是要用酶对的切下以便置换的片段，因此图3.1，3.2分别对Plfy和antiLFY进行了检测，切出的Plfy 1Kb左右，antiLFY 1.4Kb左右，均和预期相符。而对于Pnfl:GFP，GFP既是新载体需

40、要片段，又是要用酶切下的，而Pnfl并没有什么作用，因此只用检测GFP就够了，这里用了酶切和PCR两种措施，切出的GFP 750bp左右，PCR条带500bp左右，和预期相符。分别如图3.3，3.4所示。由图可见，这两个质粒均是可用的。 连接后，对重组载体进行筛选。图3.5显示酶切鉴定Plfy的成果，切出的片段大小（1Kb左右）与预期相符，并且通过和Plfy:antiLFY酶切后的成果并排跑电泳，更充足证明了切出的小片段的确是来自于Plfy:antiLFY的Plfy。同理，图3.6，3.7通过与Pnfl:GFP并排作酶切、跑电泳，证明了切出的小片段是来自于Pnfl:GFP的GFP。Plfy:G

41、FP质粒构建成功。 图3：质粒Plfy:GFP的构建图3.1: 检测Plfy:antiLFY (Plfy)Lane 1: DNA/EcoRI+HindIII DNA Marker Lane 2: Plfy:antiLFY plasmid Lane 3: Plfy:antiLFY/EcoRI+XbaI Lane 4: Plfy:antiLFY/EcoRI+XhoI Lane 5: Plfy:antiLFY/EcoRI+KpnI Lane 6: Plfy:antiLFY/PstI+XbaI Lane 7: Plfy:antiLFY/PstI+XhoI Lane 8: Plfy:antiLFY/Ps

42、tI+KpnI Lane 9: DL DNA Marker图3.2: 检测Plfy:antiLFY（antiLFY）Lane 1: DNA/EcoRI+HindIII DNA Marker Lane 2: Plfy:antiLFY质粒 Lane 3: Plfy:antiLFY/XbaI+SacI Lane 4: Plfy:antiLFY/XhoI+SacI Lane 5: Plfy:antiLFY/KpnI+SacI Lane 6: Plfy:antiLFY/XbaI+BamHI Lane 7: Plfy:antiLFY/XhoI+BamHI Lane 8: Plfy:antiLFY/KpnI

43、+BamHI Lane 9: DL DNA Marker图3.3：检测Pnfl:GFP（GFP）Lane 1: DL DNA Marker Lane 2: Pnfl:GFP/XbaI+SacI Lane 3: Pnfl:GFP质粒图3.4：检测Pnfl:GFP（GFP）Lane 1: 以无菌水为模板的PCR产物（负对照） Lane 2: 正对照 Lane 3: 以Pnfl:GFP为模板的PCR产物 Lane 4: DL DNA Marker图3.5: 新构建的Plfy:GFP酶切鉴定（检测Plfy）Lane 1: Plfy:antiLFY质粒 Lane 2: 新构建的Plfy:GFP质粒 La

44、ne 3: Plfy:antiLFY/PstI+XbaI Lane 4: Plfy:GFP/PstI+XbaI Lane 5: Plfy:GFP/PstI+BamHI Lane 6: Plfy:antiLFY/EcoRI+XbaI Lane 7: Plfy:GFP/EcoRI+XbaI Lane 8: Plfy:GFP/EcoRI+BamHI Lane 9: DL DNA Marker图3.6: 新构建的Plfy:GFP酶切鉴定（检测GFP）Lane 1: Pnfl:GFP质粒 Lane 2: Pnfl:GFP/XbaI+SacI Lane 3: Plfy:GFP/XbaI+SacI Lane

45、 4: Plfy:GFP质粒图3.7: 新构建的Plfy:GFP PCR鉴定（检测GFP）Lane 1: DL DNA Marker Lane 2: Plfy:GFP PCR产物 Lane 3: Pnfl:GFP PCR 产物 Lane 4: 以水为模板的PCR成果 Lane 5: DL DNA Marker 讨论本实验的目的是进一步研究LFY类基因的功能。我们的假设是：LFY类基因与SAM的形成与活动直接有关。本实验已获得的证据有：1. LFY基因的启动子在植物发育初期即定位活动于SAM，而不单与开花有关。 2. 以没有LFY基因启动子活动的根作为外植体进行植株再生， LFY基因启动子活动从

46、无到有的转变也许与SAM的重组直接有关。3. 用原位杂交的措施对LFY基因的转录产物进行直接检测，发现其体现与以GUS为报告基因的启动子活动具有一致性。目前，此工作还将进一步进行下去。重要从如下两个方面着手：1. 完毕根外植体植株再生整个过程中LFY基因的RNA水平整体原位杂交；2. 将Plfy:GFP转入拟南芥，在荧光下跟踪检测Plfy的活动，看Plfy活动部位和出芽部位与否具有一致性。如果确有一致性，也就是说茎端分生组织的那团细胞的确是来自茎端分生组织形成前有LFY体现活性的细胞，则更进一步的证明了我们的假设。道谢实验至此，我想对我的导师白书农专家体现深深的谢意。白教师对科学现象独到的见解

47、使我大大加深了对诸多问题的理解，让我体会到什么是真正的科学研究；白教师言语上的鼓励和行为上的协助使我克服了并将继续克服实验中遇到的一种又一种困难；白教师严谨的治学态度更使我受益匪浅。我还要感谢我们实验室的所有师兄师姐师弟师妹，感谢她们对我的协助和人们共同发明的积极向上的氛围。参照文献1 Kerstetter, R.A and S. Hake. 1997. Plant Cell 9:1001-10102 Coen, E. S. et al. 1990. Cell 63: 1311-13223 Kelly, A. J. et al. 1995. Plant Cell 7: 225-2344 Hof

48、er, J. et al. 1997. Current Biology 7: 581-5875 Pouteau, S. et al. 1997. Development 124: 3343-33516 Souer, E. et al. 1998. Development 125: 733-7427 Samach, A. et al. 1997. Plant Cell 9: 559-5708 Weigel, D. et al. 1992. Cell 69: 843-8599 Kyozuka, J. et al. 1998. PNAS 95: 1979-198210 Mouradov. A. et

49、 al. 1998. PNAS 95: 6537-654211 Bradly, D. et al. 1997. Science 275: 80-8312 Weigel, D. and O. Nilsson. 1995. Nature 377: 495-50013 Blazquez, M. et al. 1997. Development 124: 3835-384414 Engler, G. et al. 1994. Plant Mol. Biol. Reporter 12: 321-33115 Schwarz-Sommer, Z. et al. . The Plant Journal. 23: 697-702作者简介：刘曼，北京大学生命科学院细胞生物及遗传学系98级本科生，5月受“政基金”资助。感悟与寄语：参与“政基金”科研项目会让我受益终身，深深感谢李政道先生的慷慨资助，深深感谢我的导师白书农专家，深深感谢所有为“政基金”做过奉献的教师和同窗。指引教师简介：白书农，北京大学生命科学院植物发育生物学专家。