二代测序技术在非小细胞肺癌中的临床应用

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1、NGS技术在非小细胞肺癌精准治疗中的应用目 录123DNA测序技术简介非小细胞肺癌精准治疗概述NGS检测技术贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程DNA测序技术简介PART 01DNA测序技术的发展历程一代测序技术二代测序技术(NGS)三代测序技术 化学降解法 双脱氧链终止法（Sanger法）荧光自动测序技术 杂交测序技术 Roche公司的454测序技术 Illumina公司的Solexa技术 ABI公司的SOLiD技术 Life公司的Ion Torrent技术 Helicos公司的Heliscope单分子测序仪 Pacific Biosciences公司的SMRT技术 Oxford Nanopore

2、Technologies纳米孔单分子测序技术孙海汐,王秀杰.DNA测序技术发展及其展望J.科研信息化技术与应用,2009(03):18-29.20世纪中叶至20世纪末2005年至今2008年至今各大DNA测序技术的比较技术代表技术通量时间优势劣势第一代DNA测序Sanger（双脱氧链终止法）为代表低1977年1）准确率高2）读长较NGS长1）通量低、成本高2）对样本中肿瘤细胞的含量和比例要求较高3）灵敏度低第二代DNA测序（NGS）边合成边测序高2005年1）大规模平行测序2）定量3）比 Sanger技术成本低廉4）灵敏度高，适用于起始浓度很低的样本（液态活检）1）错误率较Sanger测序高2

3、）样本建库流程繁琐3）多次PCR存在系统误差，无法通过后续加深测序纠正4）数据量大，对后续数据的拼接、生物信息学分析要求极高第三代DNA测序单分子测序中-高2008年1）读长长2）单分子测序，无需建库、模板扩增，保留样本最原始的信息。3）测序同时可检测碱基修饰的情况，如甲基化、乙酰化等4）可以做全转录本的测序，分析可变剪切1）由于建库无需PCR，因此对于上机样本的浓度要求较高2）测序成本较NGS高3）目前临床应用的实例较少4）无法表达定量DNA二代测序技术（Next generation squencing，NGS）的应用ABDEC2009年，NGS用于罕见遗传病分子病因学研究和诊断遗传病20

4、08年首次报道NGS应用于急性髓细胞性白血病，此后NGS被广泛应用于肿瘤领域；2014年，NGS技术应用于血浆ctDNA 检测；2017年11月，FDA批准首个肿瘤多癌肿多基因检测平台MSK-IMPACT；2017年12月，FDA式批准了首个NGS体外诊 断（IVD）上市肿瘤2013年，NGS应用于人类胚胎细胞非整倍体筛查的临床前研究胚胎植入前遗传学诊断与筛查2008年，华大基因尝试用NGS检测胎儿游离DNA 2010年，基于NGS的无创产前筛查开始进入临床无创产前DNA检测DNA二代测序技术的应用非小细胞肺癌精准治疗概述PART 02在中国，肺癌的发病率及死亡率均居第一位陈万青，等.2013

5、年中国恶性肿瘤发病和死亡分析J.中国肿瘤2017，26（1）：1-7肺癌从单病种组织分型分子分型的演变肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类，NSCLC约占 85%，主要分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌等。肺腺癌约占NSCLC 40%-50%，肺鳞癌约20%-30%，大细胞癌约1.5%NSCLC不再是一个疾病，而是一组疾病，需要分类治疗，分子分型是关键Xu Y et al.,Ther Clin Risk Manag.2016 May 24;12:807-16 Shames et al.,J Pathol.2014 Jan;232(2):121 33Li T,et al.J

6、 Clin Oncol.2013 Mar 10;31(8):1039-49.Herbst RS et al.,Nature.2018 Jan 24;553(7689):446-454欧美人群与中国人群NSCLC的分子特征有所不同 Herbst RS等2018年1月发表于Nature的综述中指出欧美人群中：肺腺癌中常见激活突变位于PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF两大信号通路，包括癌基因EGFR、KRAS、ERBB2/3、MET、ALK、RET、ROS、BRAF等。失活突变包括抑癌基因 TP53、KEAP1和NF1等肺鳞癌中常见激活突变包括癌基因FGFR1-3、PIK3CA、KRAS、A

7、KT、BRAF 等，较少见EGFR扩增。失活突变包括抑癌基因TP53、CDKN2A欧美人群与中国人群NSCLC的分子特征有所不同Oncotarget.2016 Jul 5;7(27):41691-41702.A.1770例中国NSCLC 患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR、KRAS、ALK、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中EGFR突变比例为 50.3%，占据NSCLC突变半壁江山，远高于欧美人群27%B.904例非吸烟肺腺癌患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR、ALK、KRAS、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等

8、。其中 EGFR突变比例高达74.5%，表明EGFR基因在中国肺腺癌患者中至关重要肺癌进入精准治疗时代：根据分子分型决定治疗方案Deborah B et al.,JAMA Oncol 2018 Apr 01;4(4).NGS二代测序ddPCR数字PCRARMS-PCRFISH荧光原位杂交IHC免疫组化01.02.03.04.05.临床常用的分子检测诊断技术用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究扩增阻碍突变系统(ARMS)，利用PCR引物的3端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物；只有

9、在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，野生型的不扩增通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术在Sanger测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息检测方法检测方法优势优势劣势劣势可检测的变异形式可检测的变异形式AMRS-PCR1、灵敏度3%-10%2、扩增

10、和检测同时进行，封闭的体系，减少污染的可能性1、只能检测已知突变2、如果检测突变点或者类型较多，出现特异产物概率也增加3、当检测位点较多时，对DNA样本需求增加4、无法测融合、大片段插入/缺失点突变、小片段插入/缺失荧光原位杂交FISH1、灵敏度高、特异度高2、空间定位准确，可同时分析分裂期和间期多个细胞，并进行定量1、通量低、成本高2、对操作和判读技术要求高，不同读片者判读差异较大拷贝数变化、大片段插入/缺失、融合/重排。扩增的金标准免疫组化IHC1、可对组织和细胞中相应的抗原进行定性、定位及定量研究2、经济快捷1、抗体的选择2、检测者组织的固定3、观察者解释方面的差异仅检测蛋白表达水平dd

11、PCR1、单位点精准度非常高2、可以进行动态监测1、多位点血检匹配度不高，2、已知位点测序点突变、小片段插入/缺失二代测序NGS1、大规模、高通量2、能检测各种变异形式3、灵敏度1%-3%1、成本较高2、引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统的偏向性，同时读长也比较短3、对数据注释和报告解读要求高点突变扩增融合/重排插入/缺失临床常用的分子检测诊断技术优劣势比较CAP、IASLC及AMP三大权威机构推荐由单基因检测发展为多基因检测J Mol Diagn.2013 Jul;15(4):415-53.J Mol Diagn.2018 Mar;20(2):129-159.近年NC

12、CN指南均建议进行广泛基因检测检测方法样本来源变异类型点突变新位点融合扩增突变负荷MSIEGFR/BRAFMET-14 exon skipALK/ROS1/RETMET/HER2TMB-IHC组织有限（BRAF）否是是否是血液否否否否否否FISH组织否否是是否否血液否否否否否否PCR（ARMS/ddPCR）组织是否是（已知类型）是否否血液是否是（已知类型）是否否NGS组织是是是（已知+未知）是是是血液是是是（已知+未知）是是是传统分子检测方法存在局限性，NGS平台能够全面满足NSCLC现有分子检测诊断需求NGS检测技术贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程PART 03NGS检测贯穿非小细胞肺癌精准治疗

13、全程NGS在非小细胞肺癌中的应用早期发现分子分型用药指导疗效预测复发监控预后评估肿瘤组织（蜡块、切片、新鲜组织）液体（血液、尿液、胸腹水）NGS+ctDNA有助于肿瘤的早期发现Jillian Phallen et al.,Sci Transl Med.2017 Aug 16;9(403)Jillian运用基于NGS平台的目标错误校正测序(TEC-Seq)方法，对ctDNA的序列变化进行超灵敏的直接评估发现：健康人群中未检出肿瘤特异性基因突变；以健康人作为对照，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌患者都检测到了肿瘤特异性突变；早期肿瘤就能够检出肿瘤特异性基因突变；检测肿瘤特异性基因突变与癌症的临床分期

14、呈正比Jillian认为基于NGS平台的TEC-Seq分析方法为早期肿瘤的无创检测提供了广泛适用的方法，可能对癌症患者的筛查和管理有用，提示ctDNA用于常见癌种早期诊断的可能性。CSCO指南认可NGS在非小细胞肺癌分子分型的作用中国临床肿瘤学会指南工作委员会，中国临床肿瘤学会原发性肺癌诊疗指南2018版NGS有助于分析非小细胞肺癌分子分型演讲，指导后续治疗英国TRACERx肺癌研究计划的首个成果2017年发表于新英格兰医学杂志，其中提到：NSCLC腺癌“进化”的早期：诸如EGFR、MET、BRAF 和TP53之类基因的突变/扩增往往发生在克隆水平；这些基因往往与NSCLC的 形成有关，属于驱

15、动基因NSCLC“进化”的晚期：75%的肿瘤出现了亚克隆水平的各种变异，而且这些变异还位于肿瘤的不同区域；是造成肿瘤内部异质性的原因M.Jamal-Hanjani et al.,N Engl J Med.2017 Jun 1;376(22):2109-2121早期晚期NGS指导非小细胞肺癌个体化用药及疗效预测Tsao et al.,J Thorac Oncology.Vol.11 No.5:613-638Deborah B et al.,JAMA Oncol 2018 Apr 01;4(4).晚期非小细胞肺癌药物治疗靶向、免疫、化疗三分天下，此时基于NGS平台的多基因检测优势明显NGS指导非小

16、细胞肺癌个体化用药及疗效预测Rizvi N A,Hellmann M D,et al.Science,2015,348(6230):124-128Rizvi对非小细胞肺癌(NSCLC)进行全外显子测序，发现肿瘤中更高的非同义突变负荷(H-TMB)人群有更好的无进展生存期(PFD)，并且对PD-1 单抗(pembrolizumab)有持久的反应(DCB)NGS能够帮助发现非小细胞肺癌耐药机制及判断预后Ke EE等纳入224名EGFR突变并获得EGFR-TKI耐药的晚期NSCLC患者，分析T790M突变、MET扩增、组织学转化、KRAS、PIK3CA突变、ALK融合等耐药机制，其发现：19-del

17、 缺失组的 T790M 突变（50.4%）显著比L858R突变组（36.5%）高；T790M 突变的患者中观察到明显的OS益处，中位OS 36.0个月；在调整T790M基因型的多变量分析中，EGFR突变亚型不再被认为是显著的；结果报道：EGFR T790M 高比例突变对于 Exon19 缺失比 L858R突变的患者有更好的存活率，预后更好。Ke EE,et al.,J Thorac Oncol.2017 Sep;12(9):1368-1375.NGS+ctDNA早期提示肿瘤复发Chaudhuri AA，et al.,Cancer Discov.2017 Dec;7(12):1394-1403.

18、Chaudhuri AA等采用深度测序(CAPP-seq)循环肿瘤DNA(ctDNA)分析方法，对40例I-III期肺癌患者和54名健康成人的255份样本进行了癌症个性化监测，其发现：94%的患者在治疗后的血液样本中检测到ctDNA定期接受ctDNA监测的患者，在接受根治性治疗后，第一次检测到ctDNA的时间，比CT明确提示肿瘤复发，平均提前了5.2个月ctDNA中相应基因检测，还可以用来区别到底是疾病复发还是正常术后改变NGS正在以更高的标准，快速进入临床服务患者FDA自2016年底至今已批准6款 NGS技术产品，以期降低NGS技术 产品潜在的检测错误和解读错误风险，保证该类产品检测的安全性

19、、有效性2016.12.19 FoundationFocus CDx BRCA BRCA 1/2 晚期卵巢癌 Rucaparib2017.6.22 Oncomine Dx EGFR、ROS1、BRAF 非小细胞肺癌 吉非替尼、克唑替尼、达拉菲尼、曲美替尼2017.6.29 Praxis Extended RAS Panel KRAS(exons 2,3,4)NRAS(exons 2,3,4)转移性结直肠癌 帕尼单抗2017.11.15 MSK-IMPACTTM FFPE样本的468个基因 MSI、MMR所有实体瘤 补充诊断2017.12.1 FoundationOne CDx FFPE样本的324个基因 所有实体瘤 替换、插入、缺失、拷贝数变化、基因重排等突变，MSI、TMB伴随诊断2018.1.12 BRACAnalysis CDxTM 生殖系BRAC1/2 晚期卵巢癌、乳腺癌 奥拉帕尼第一个基于NGS平台的多癌种多基因补充诊断第一个基于NGS平台的多癌种多基因伴随诊断小结基于NGS平台的基因检测贯穿肺癌精准治疗“全程”，能够做到早期、灵敏、全面、实时、动态监测，测序成本较低NGS多基因检测符合临床需求NGS技术产品：多癌种多基因panel设计是趋势