药敏试验方法1

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1、药敏试验方法：K-B 法：1 从孵育了 16-24 小时的琼脂平板上（血平板），挑出单个菌落，直接用生理盐水制成 0.5 麦氏单位。2 在 15 分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多 的菌液。3 用棉拭子在无菌的 M-H 培养基表面化线接种，再重复操作两次，每次将平板转动 60 度，每次接种都应 保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。4 将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。每个纸片都应压一下，以保证与平板表面完全接触。每个纸片中 心间距24mm。纸片一旦与平板接触，不应再移动。5 贴完纸片后，应在 15 分钟内放入 35 度孵箱。嗜血杆

2、菌属，链球菌属放入 3%-5% 的 CO2 烛缸。6 孵育 24 小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与 NCCLS 手册比较，作出结果判断。 说明：细菌药敏结果的判断以 NCCLS 为标准，所以药敏试验的每一步都应严格按照 NCCLS 操作，否则将失 去意义。链球菌、奈瑟菌属、流感嗜血杆菌、除铜绿假单抱菌和不动杆菌外的假单抱菌属不用K-B法. 肺炎链球菌胶乳凝集测定法1 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。2从冰箱取出鉴定试剂（SIidexpneumo-kit）于室温。3在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。4 轻轻晃动玻片 2 分钟，观察结果。5 2分钟内

3、，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。注：R3为阳性对照。药敏纸片的选择1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）头抱噻肟（CTX ）头抱唑林（CZ ）头抱他定（CAZ）氨苄西林（AM）哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）头抱噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头抱咲辛（CXM）庆大霉素（GM）头抱噻肟/棒酸（CTX/CA）头抱他定/克拉维酸（CAZ/CA）羧苄青霉素（CB）奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）亚安培南头抱匹肟（FEP）头抱克罗（CEC）2、铜绿假单抱菌/不动杆菌妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）头抱哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头抱匹肟头抱噻

4、肟（CTX）环丙沙星（CIP）头抱他定（CAZ）左旋氧氟沙星（OFL ）亚安培南哌拉西林/三唑巴坦3、金黄色葡萄球菌苯唑西林（0X）青霉素G （P）头抱唑林（CZ）阿米卡星（AN）红霉素（E）头抱噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）万古霉素奥格门丁（AMX/CA ）哌拉西林/三唑巴坦头抱噻吩（ CF）4 、肠球菌氨苄西林（AM）万古霉素环丙沙星（CIP）庆大霉素（GM）红霉素（E）氧氟沙星（OFL）5、除肺炎链球菌外链球菌氨苄西林（AM）头抱噻肟（CTX）万古霉素红霉素（E）氧氟沙星（OFL）克林霉素（CM）肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌和大肠杆菌 ESBLs 的检测MH 培养基上贴头孢他定，头孢他定/

5、克拉维酸，头孢噻肟/棒酸，安曲南。如头抱他定的抑菌圈22mm,安曲南27mm，头抱噻肟27mm,意味可能有ESBLS产生。 如头抱他定/克拉维酸与头抱他定，头抱噻肟/棒酸与头抱噻肟的差值5mm，则确证ESBLS产生。 耐药机制。一代头孢对普通变形杆菌、枸橼酸杆菌、肠球菌、假单孢菌属、沙雷氏菌属、拟杆菌属无效。第二代头孢 对假单孢菌属、不动杆菌属、沙雷氏菌属、肠球菌无效；肠球菌对头孢类天然耐药。氨基糖甙类抗生素阿 米卡星与庆大霉素不完全交叉耐药。红霉素类、四环素类等抗生素内部有相互交叉耐药。金黄色葡萄球菌耐万古霉素、无乳链球菌耐青霉素和氨苄青霉素、无乳链球菌和 D 群链球菌耐万古霉素和 替拉考宁

6、为不可能的表型。洋葱伯克霍德菌对氨基糖甙类、亚安培南天然耐药。 除表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌外，替拉考宁耐药的凝固酶阴性的葡萄球菌不常见。 金黄色葡萄球菌对复方新诺明耐药为罕见表型。氨苄青霉素对非发酵类不宜应用。 对于葡萄球菌，苯唑西林耐药，青霉素敏感是不可能的。NCCLS 关于细菌药敏实验的说明总评论：1、头孢噻吩可以代表头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢氨苄、头孢克洛、和头孢羟氨苄。但是，头孢 唑林、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢丙烯应单独测试，因为某些对这些药物敏感的菌株对头孢噻吩是耐药的。2、利福平不能单独用于化疗。肠杆菌科1 对于沙门菌属和志贺菌属只有氨苄西林、喹诺酮、和甲氧苄啶/磺胺甲恶

7、唑可用于常规试验与报告。初此 之外，对于沙门菌属和志贺菌属的肠道外分离株，应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素。2、克雷伯菌属和大肠艾希菌的产ESBLS株对青霉素、头抱菌素类或安曲南临床治疗可显耐药性，尽管在体 外药敏试验对其中某些抗生素敏感。对于所有产ESBLs株，应报告为耐所有青霉素类、头抱菌素及安曲南。3、随着3 代头孢菌素的治疗，肠杆菌属、枸橼酸菌属和沙雷菌属可发展其耐药性。最易敏感的菌株在开始 治疗3-4天就可变为耐药，因此要反复测试这些菌株。葡萄球菌1、青霉素敏感的葡萄球菌对 FDA 批准的用于葡萄球菌感染的其他青霉素类、头孢菌素和碳青烯类也是敏 感的。青霉素耐药而苯唑西林敏感的菌

8、株对B-内酰胺酶不稳定的青霉素是耐药的，但对其他B-内酰胺酶稳 定的青霉素、B-内酰胺酶抑制剂复合药、相关的头抱类和卡巴陪南是敏感的。苯唑西林耐药的葡萄球菌对 现在可用的所有B-内酰胺类抗生素是耐药的。因此仅测试青霉素和苯唑西林就可以推知一大批B-内酰胺类 抗生素的敏感性与耐药性，不必常规测试其他青霉素类、B-内酰胺类抑制剂复合药、头抱类和卡巴陪南类。2、绝大多数的MRS对多种抗生素耐药。包括B-内酰胺类、氨基糖貳类、大环内酯类、克林霉素和四环素。 观察到多重耐药应该是对甲氧西林可能耐药的线索。3、长期应用喹诺酮类治疗的过程中葡萄球菌可发展其耐药性，因此应重复测试耐药性。肠球菌1、对于肠球菌属

9、，头孢菌素、氨基糖甙类（除了筛选高水平耐药性）、克林霉素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑在 体外可能有活性，但临床无效，因此不能报告细菌对这些药物敏感。2、青霉素敏感性可以用于不产B-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、酰基氨苄西林、氨苄西林/舒 巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林以及哌拉西林/三唑巴坦的敏感性3、氨苄西林是氨苄西林和阿莫西林类的代表药。氨苄西林的结果可用来判断不产B-内酰胺酶的肠球菌对阿 莫西林/克拉维酸和氨苄西林/舒巴坦的敏感性。4、青霉素的结果可预测不产B-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿莫西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/ 克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦的敏感性。5、对于血和脑脊液

10、分离株需用头抱硝噻吩B-内酰胺酶试验，阳性提示对青霉素耐药，同时对酰胺基、羧基 和脲基青霉素耐药。细菌鉴别要点1、革兰阳性球菌 所有革兰阳性球菌第一步为触酶试验。 通常触酶阳性为葡萄球菌和微球菌，阴性为链球菌科。但不排除例外，气球菌为弱阳性。粪肠球菌偶有阳 性。操作触酶试验应尽量避免用铂金取菌环（针）在H2O2上涂菌，而应先涂菌，在滴H2O2，步骤不能颠 倒。因为铂金可以和H2O2产生假阳性反应。H2O2必须新鲜，若放置过久或暴露于光线下容易分解，必须 保存于4C冰箱。实验所用菌须大量，不可挑到琼脂，会产生假阳性。对触酶阳性的革兰阳性球菌，应继续做玻片法血浆凝固酶试验，此为检出葡萄球菌，如阳性

11、一般为金黄色 葡萄球菌；如阴性应做试管法凝固酶实验确证，玻片法仅为筛选实验。血浆凝固酶实验用血浆须用兔或猪 血浆，新鲜血浆不稳定，可能发生自我凝集或形成颗粒产生浑浊或产生沉淀而导致判度错误；不可使用人 血浆，其含有抑制物质回干扰实验结果。触酶阴性为链球菌科，根据菌落溶血进行下一步鉴定。a溶血：草绿色链球菌；肺炎链球菌；肠球菌 B溶血：A群链球菌；B群链球菌，部分D群链球菌 肠球菌也有不溶血菌落，不能根据溶血判断肠球菌。链球菌主要实验：胆汁七叶苷，七叶苷，菊糖， CAMP ， 杆菌肽，高盐，奥朴托辛，胆盐溶解。肠球菌为致病菌，且肠球菌与非肠球菌耐药机制不同，应进行鉴别，肠球菌分为粪肠球菌和屎肠球

12、菌；非 肠球菌分为牛链球菌和马链球菌。肠球菌对青霉素耐药，非肠球菌对青霉素敏感。肠球菌的药敏注意高耐 氨基糖貳的细菌，如高耐氨基糖貳则意味氨基糖貳与B内酰胺类药物合用无协同作用。肺炎链球菌与草绿色链球菌鉴别：肺炎链球菌奥朴托辛、菊糖、胆盐溶解实验皆为阳性。但这 3 个实验都 非特异，需联合应用方为最佳。肺炎链球菌的青霉素药敏实验应注意，当青霉素K-B法）的抑菌圈直径大 于或等于19mm时为敏感，当小于19mm时不能确定是否中敏或耐药，应做MIC稀释确证。2、革兰阴性杆菌 包括肠杆菌科、非发酵菌和弧菌科。 第一步实验为氧化酶实验。氧化酶阴性为肠杆菌科；阳性为非发酵菌和弧菌科。 肠杆菌科包括大肠杆菌、变形杆菌、普罗菲登斯菌及摩根菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷 菌属、耶尔森菌属。非发酵菌包括铜绿假单孢菌、黄单孢菌、不动杆菌等。氧化酶实验注意事项：需用铜绿假单抱菌做阳性对照。0秒内判读结果有效，而以10秒内最佳。要用含微量铁的取菌环或针，可用棉棒替代。革兰阴性杆菌的鉴定以API系列为国标，其他生化管仅为常规鉴定。