胶体金制备技术

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1、第十九章 金免疫技术金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由 Faulk 和 Taylor 始创，最初用于免疫电镜技术。迄今为止，金标记仍主要用于免疫组 织化学中。在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型 的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的简便、快速 检验方法。第一节 免疫胶体金的制备一、胶体金的特性和制备（一）胶体金的结构胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是由金盐被还原成原金 后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的 双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（A

2、uC1 -），外层离子层H+则分2 散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球 形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微 镜下可观察胶体金的颗粒形态。（二）胶体金的特性1 胶体性质胶体金颗粒大小多在1lOOnm，微小金颗粒稳定地、均匀地、 呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特 性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而 打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。 某些蛋白质等大分子物质有保护胶体

3、金、加强其稳定性的作用。2. 呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最 小的胶体金（25nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（1020nm）是酒红色的， 较大颗粒的胶体金（3080nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体 金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。3. 光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波 长（入max）在510550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的 入max偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的入max则偏于短波长，表19-1所列 为部分胶体金的入max。（三）胶体金的制备1. 制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸（

4、HauC1 ）是主要还原材4料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂 类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：(1) 将HauCl先配制成0.01 %水溶液，取100ml加热至沸。4(2) 搅动下准确加入一定量的1 %柠檬酸三钠(NaCHO 2H0)水溶液。3 6 5 72(3) 继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸 钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约 23min(4) 冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。用此法可制备16147nm粒

5、径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的 柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。表 19-1 四种粒径胶体金的制备及特性胶体金粒径(nm)1 %柠檬酸三钠加 入量(ml) *胶体金特性呈色A max162.00橙色518nm24.51.50橙红522nm411.00红色525nm71.50.70紫色535nm*还原 100ml0.01%HauC1 所需量42注意事项( 1 )氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。(2) 氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使 用金属药匙称量氯金酸。(3) 用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高

6、质量的 去离子水。(4) 是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用 蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用 5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸 泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。(5) 胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体 金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大 小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好 的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此 次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以 粗略估计制得的

7、金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描久max来估计金颗粒 的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以 比较精确地测定胶体金的平均粒径。胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如 0.02 NaN ）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗 3 粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗 粒。二、免疫金的特性和制备（一）免疫金的特性胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯 上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活 性物质（抗原或抗体）结合，这类

8、胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免 疫金（immunogold）。胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体 金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因 此环境 pH 和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白 质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。（二）免疫金的制备1. 用0. 2mol/LK CO或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则 上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多 次试验才能确定。在调节胶体金的 pH 值时应注意，胶体金会阻塞 pH 计的电极，不

9、可直接将电 极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG, 20000）稳定胶 体金后，再胶体金的 pH 值。2. 将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应 25min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标 记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析 去盐。3. 加入浓度为0.2%的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。4离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒 径而异：对 5nm 金颗粒可选用 40000r/min 离心 1h；8nm 金颗粒用 25000r/min 离心 4

10、5min；14nm 金颗粒用 25000r/min 离心 30min，40nm 金颗粒用 15000r/min 离心 30min。5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。 如此洗涤24次。以彻底除去未结合的蛋白质。6免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳 定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和 BSA 是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便 于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合 理选择是十

11、分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。二、胶体金pH值的调整胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于 pH 值，一般只有在蛋白质等电点 (PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的 pH 值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的 pH 值时可用 O.lmolK CO，需要降低胶体金的pH值时可用O.ln HCl。测定金溶液的pH可能 23损害 pH 测定计的探头，因此，一般用精密的 pH 试纸测定其 pH 即可。四、蛋白质的胶体金标记当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳 pH 值被确定以后便可进行标记。具体 步骤如下：(1) 根据用以标记的胶体金的总量

12、计算出所需要的待标记蛋白质的总量。(2) 在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中(pH已调至PI超过 0.5pH)，加入蛋白质时应逐滴加入，lmg的蛋白质大约5min加完。(3) 在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1%,或加 入3%聚乙二醇(PEg MW20000)使其终浓度为0.05%,我们对比了 BSA和PEG稳 定胶体金的效果，BSA稳定的标记胶体金，放在4匸达2年半仍然保持良好性能， 而用PEG稳定的标记胶体金放在4C1年左右就有分层现象，而且染色效果显著 下降。因此，我们认为最好还是用 BSA 作稳定剂。(4) 将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放入蔗

13、糖或硅胶中浓缩， 浓缩到原体积的 1/10 量，浓缩完毕后纯化。离心法纯化时，不要浓缩。五、胶体金标记蛋白质的纯化标记好的免疫金探针必须经过纯化处理以后才能用于免疫细胞化学染色。纯 化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程中可 能形成的各种聚合物。(一)调整与超速离心法(1) 将标记的大于10nm的胶体金溶液选用15000r/min 4匸离心15min,吸 出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物。(2) 一般在 10nm 以上所标记的胶体金均可在调整离心机上离心,小于 10nm 颗粒的胶体金用超速离心机离心，在4匕离心1h左右，弃上清，将沉淀以原体积 的0.02mol./

14、l TBSpH8.2 (内含1%BSA，0.05%叠氮钠)溶解，重复离心23次， 沉淀溶于原体积的1/10TBS中。4保存备用。为了得到颗粒均匀一致的免疫金 试剂，上述粗提制剂可用 10%30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集 不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂。(二)凝胶过滤法为纯化免疫金探针的最好方法，其特点是简便，过滤的胶体金颗粒比较均匀， 不容易凝集，而离心方法转速高，时间长，胶体金颗粒沉淀容易凝集，用凝胶过 滤克服了这一弱点。选用本方法时胶体金溶液必须用牛血清白蛋白作稳定剂。具 体操作过程如下：(1) 将浓缩好的胶体金以1500r/min离心去掉大的聚合物。吸出上清待过 柱。(2

15、) 柱高34cm,直径1cm,加样体积为柱床体积的1/10。(3) 丙烯葡聚糖 S-400 (Sephacryls400, Pharmacia, Sweden)装柱后 用0.02mol/l pH8.2 TBS平衡层析柱(pH7.4者用于标记的SPA)，平衡好后， 吸取上清胶体金液体加入层析柱内，加样时请注意不要破坏S400的界面。(4) 用0.02mol/l pH8.2 TBS洗脱，先行滤出的液体有少量微黄不透亮的 液体，紧接着是浓度高红色而透亮的胶体金，注意颜色的变化，如红色变淡，变 黄立刻停止收集。如Sephacryls400没有，也可以用Sepharose - 4B或6B 代替(Pharmacia,Sweden)也能收到较好的效果。玻璃仪器的清洁 制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃仪器清洁是非常关键 的一步。如果玻璃仪器内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒 的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或浑浊不透明。我们 的经验是制备胶体金的所有玻璃仪器先用自来水把玻璃仪器上的灰 尘流水冲洗干净，加入清洁液(重烙酸钾 1000 克，加入浓硫酸 2500ML，加蒸馏水至10000ML)浸泡 24 小时，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃仪器用洗洁剂 3-4 次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3-4 次，再用双蒸馏水洗3-4 次，烤箱干燥后备用。