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1、凯氏定氮法凯氏定氮法杜马斯法杜马斯法福林酚法福林酚法染色法染色法6.25=6.25=6.38=5.952NH2(CH2)2COOH+13H2SO4 (NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点作为增温剂，提高溶液沸点加氧化剂加氧化剂 加速有机物氧化速度加速有机物氧化速度=NH3+H2O用用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定 指示剂：混合指示剂（甲基红指示剂：混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿）溴甲基酚绿）指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸）（碱）（碱）（酸）（酸）反应式为：反应式为：NHNH3 3+H+H
2、3 3BOBO3 3=NH=NH4 4+H+H2 2BOBO3 3-H H2 2BOBO3 3-+H+H+=H=H3 3BOBO3 3 用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再标准溶液吸收，再用用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。标准溶液滴定过剩的酸液。量量NaOHNaOH少少1000W%100K)(CMVVN211.装水至装水至 2/3 容积容积处，加甲处，加甲基橙数滴基橙数滴及硫酸数及硫酸数毫升以保毫升以保持酸性持酸性7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色水蒸气蒸馏至指示剂变绿色开始计时，蒸馏开始计时，蒸馏10min，将管，将管尖端提离液面再蒸馏尖端提离液面再蒸馏1min，用，
3、用水冲洗管尖后停止蒸馏水冲洗管尖后停止蒸馏同时做空白同时做空白8.吸收液用吸收液用0.01000mol/LHCl标准溶液滴定至标准溶液滴定至微红色为终点微红色为终点2.管下端管下端插入液面插入液面下下(瓶内先瓶内先装硼酸液装硼酸液及混合指及混合指示剂示剂2滴滴)3.消化液消化液 10mL4.NaOH溶液溶液5.水洗漏水洗漏斗数次斗数次6.夹好漏斗夹好漏斗夹，水封。夹，水封。4.5.6步操步操作要作要迅速迅速微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法凯氏定氮仪凯氏定氮仪凯氏定氮仪凯氏定氮仪NH2CONHCONH2 +NH3NH2CONH2+NH2CONH2150160双缩脲双缩脲能和硫酸铜的碱性能和硫酸铜的碱
4、性溶液生成溶液生成紫色络和物紫色络和物。紫色络合物。紫色络合物。取两组测定的取两组测定的A A540值的平均值，即值的平均值，即A A540540为纵坐标，蛋为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2 2、样品测定、样品测定取取4 4支试管分成两组，按下表平行操作：支试管分成两组，按下表平行操作：%100(%)cNY固体样品蛋白质的含量(1)(1)在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋在碱性条件下，蛋白质与铜离子作用生成蛋白质白质铜络合物。铜络合物。(2)(2)此络合物将试剂磷钼酸此络合物将试剂磷钼酸磷钨酸磷钨酸(olinolin试剂试剂)还原，混合物深蓝色
5、还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物磷钼蓝和磷钨蓝混合物)。凯式定氮法凯式定氮法双缩脲双缩脲杜马斯杜马斯福林福林-酚酚原理原理装置装置溶剂溶剂时间时间灵敏灵敏度度干扰干扰总氮量总氮量蛋白氮蛋白氮总氮量总氮量蛋白氮蛋白氮凯式定氮装置凯式定氮装置分光光度计分光光度计高温装置、高温装置、GCGC分光光度计分光光度计浓硫酸浓硫酸用量较少用量较少不需要不需要福林福林-酚试剂酚试剂长长简单快速简单快速3min3min简单快速简单快速较小较小有干扰有干扰较小较小酸类及柠檬酸类及柠檬酸类酸类染色法染色法紫外紫外吸收法吸收法水杨酸比色法水杨酸比色法 采用凯氏定氮法测一样品的粗蛋白含量，根据下采用凯氏定氮法测
6、一样品的粗蛋白含量，根据下列记录的数据计算：列记录的数据计算：水份含量水份含量=8.0%，1 号样品重量号样品重量=1.015g，2号样号样品重量品重量=1.025g，用于滴定的标准，用于滴定的标准HCl浓度浓度=0.1142mol/L，1号样品所用的号样品所用的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=22.0mL，2号样品的号样品的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=22.5mL，空白的空白的HCl溶液的毫升数溶液的毫升数=0.2mL，分别以样品的干，分别以样品的干基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有基和湿基计算粗蛋白质含量，假定该蛋白质含有17.5%的氮。的氮。氨基酸本身有碱性氨基酸本身有碱性-
7、NH-NH2 2基，又有酸性基，又有酸性-COOHCOOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与与-NH-NH2 2结合，碱性消失，再用强碱来滴定结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH-COOH基。基。反应式（有几种不同的推论）如下：反应式（有几种不同的推论）如下：双指示剂：百里酚酞双指示剂：百里酚酞+中性红指示剂中性红指示剂+中性红，用中性红，用NaOHNaOH滴定滴定+百里酚酞百里酚酞+中性甲醛中性甲醛+NaOH+NaOH滴定滴定 根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基根据氨基的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示酸性，将酸度计的玻璃电的碱性，使羧基
8、显示酸性，将酸度计的玻璃电极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用极和甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用NaOH NaOH 标准溶液滴定，根据酸度计指示的标准溶液滴定，根据酸度计指示的pH pH 值判断和控制滴定的终点。值判断和控制滴定的终点。pH8.28.29 9.2.2氨基酸自动分析仪法氨基酸自动分析仪法 在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油在测定某厂酱油氨基酸态氮含量时，酱油5mg5mg于于100mL100mL容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液容量瓶中，加水定容，混匀后吸取此液20mL20mL进行测定，用进行测定，用0.05N0.05N氢氧化钠滴定至氢氧化钠滴定至pHpH值为值为8.28.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液7.0mL,7.0mL,加入加入10.0mL10.0mL甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至甲醛溶液，混匀。用标准溶液继续滴定至pH9.2pH9.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液10.12mL,10.12mL,同法作空白实验，滴定至同法作空白实验，滴定至pHpH值值为为8.28.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液0.08mL,0.08mL,加入甲醛后滴定至加入甲醛后滴定至pH9.2pH9.2时，消耗标准碱液时，消耗标准碱液0.90ml0.90ml。问该样品的氨基酸态氮含量？。问该样品的氨基酸态氮含量？0.301%你你 算算 对对 了了 吗？吗？
蛋白质的测定#课件参考
