PCR技术在科研中的应用

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1、 PCR技术技术 在科研中的应用在科研中的应用PCR的定义：的定义：聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。这是由高温变性、低温退火（复性）和适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增的一种方法。PCR原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR的反应体系：的反应体系：l 10扩增缓冲液10ul l4种dNTP混合物各200umol/L l引物各10100pmol l模板DNA0.12ug lTaqDNA聚合酶2.5u lMg2+1.5mmol/L

2、 l加双或三蒸水至100ul lPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五 种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)PCR 的反应程序的反应程序:预变性（Initial denaturation）:模板DNA完全变性，一般94加热3-5分钟。变性:循环中一般95，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。延伸:引物延伸一般在72进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定。Tm值:4(G+C)+2(A+T)是对Tm的一个估计。最后延伸:在最后一个循环后，反应在72维持5-15分钟使引

3、物延伸完全，并使单链产物退火成双链。循环数：大多数PCR含25-35循环。巢式PCR：巢式巢式PCR通过两轮通过两轮PCR反应，使用两套引物反应，使用两套引物来扩增特异性的来扩增特异性的DNA片段。第一轮片段。第一轮PCR中，中，得到用外引物扩增产生的产物，此产物为模板，得到用外引物扩增产生的产物，此产物为模板，在内引物的存在下进行第二轮在内引物的存在下进行第二轮PCR扩增。内扩增。内引物的功能是特异的扩增第一轮引物的功能是特异的扩增第一轮PCR产物内产物内的一段的一段DNA片段，从而提高反应的特异性。片段，从而提高反应的特异性。巢式PCR原理示意图：巢式PCR的特点：巢式巢式PCR，极大的提

4、高了，极大的提高了PCR的的敏感性敏感性，可以使原始模板很低的样品扩增出最终可以使原始模板很低的样品扩增出最终产物。由于模板和引物的改变，降低了产物。由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的保证了反应的特异性特异性，还保证了整个反，还保证了整个反应的准确性及可行性应的准确性及可行性。实时荧光定量PCR(Real time Quantitative PCR)：实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。l荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，

5、它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。l每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）。荧光定量荧光定量PCR化学原理化学原理 非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan1、SYBR Green 法法溶解曲线分析：溶解曲线分析：l扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征

6、峰（Tm，DNA双链解链50的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。l如果溶解曲线做出来只有单峰，且出峰位置是退火温度，那么这个是目的产物发出的荧光，实验结果有效。如果出现多锋或退火温度不对，那么这个实验结果是不可信的，需要再次调整。SYBR Green法优缺点法优缺点l优点:l对DNA模板没有选择性l适用于任何DNAl使用方便-不必设计复杂探针l非常灵敏l便宜2、TaqMan探针法探针法TaqMan作用机理作用机理53外切酶活性：这种酶活性只对这种酶活性只对DNA上配对部分（双链）磷酸上配对部分（双链）磷酸二酯键有切割作用，方向是二酯键有

7、切割作用，方向是53。每次能切。每次能切除除10个核苷酸，而且个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激的聚合作用能刺激53外切酶活力达外切酶活力达10倍以上。倍以上。TaqMan法优缺点法优缺点随机突变PCR：蛋白质的结构与其功能之间的关系是蛋白质组学研究的重点内容之一，体外突变技术是研究这种复杂关系的有力工具,也是实验室中改造/优化基因常用的手段。利用易错PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法非常适用于蛋白质全局性分析，有人也称之为饱和突变（saturation mutagenesis）。随机突变PCR的实施策略：l增加增加Mg2+浓度浓度l增加增加dNTP浓度

8、浓度l加入锰离子和增加加入锰离子和增加dGTP l增加循环次数增加循环次数l用低保真的用低保真的TaqDNA聚合酶聚合酶l用同一对引物多次用同一对引物多次PCR随机突变PCR：l改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入基因突变。向目的基因中随机引入基因突变。l将一次扩增得到的突变基因作为下一次扩增的模将一次扩增得到的突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机板，连续反复地进行随机PCR，使每一次扩增得，使每一次扩增得到的突变累积而产生重要的有益突变。到的突变累积而产生重要的有益突变。l随机突变随机突变PCR的优点是可以有效的

9、产生突变，而的优点是可以有效的产生突变，而且操作方法简单。且操作方法简单。RT-PCR：RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录）即逆转录PCR，是将是将RNA的逆转录（的逆转录（RT）和）和cDNA的聚合酶链的聚合酶链式扩增反应（式扩增反应（PCR）相结合的技术。可用于检）相结合的技术。可用于检测细胞测细胞/组织中基因表达水平，细胞中组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒病毒的含量等的含量等。RT PCR的基本原理：的基本原理：PCR技术的常见其他应用：技术的常见其他应用：l扩增目的基因和鉴定重组子扩增目的基因和鉴定重组子l基因功能和表达功能研究基因功能和表达功能研究l基因组测序基因组测序l制备单链模板制备单链模板