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1、水通道蛋白4在缺氧缺糖后水肿星形胶质细胞中的作用唐兆华，廖正步，蒋光元，支兴刚，石全红，何朝晖，詹 彦 （400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院神经外科）摘要 目的 探讨水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）在缺氧缺糖培养后水肿星形胶质细胞中的表达变化与作用。方法 星形胶质细胞分为正常组和缺氧缺糖组，缺氧缺糖组细胞经过5 h缺氧缺糖后恢复正常条件培养至0.5、2、8、24 h和48 h 5个时间点时,用光镜观察细胞形态变化，RT-PCR及免疫荧光法测定AQP4的mRNA及蛋白的表达变化。结果 在缺氧缺糖后0.5 h，细胞肿胀逐渐形成并继续加重，2 h肿胀达到高峰，至8 h和24
2、h时肿胀逐渐消退，48 h细胞基本恢复正常形态。RT-PCR和免疫荧光检测：在缺氧缺糖后0.5 h，AQP4 mRNA和蛋白的表达均较正常组明显下降（P0.05），2 h回升，8 h明显超过正常水平，达最高值（P0.05），24h有所下降，但仍明显高于正常水平（P98%（图1）。倒置显微镜下观察：原代成熟的星形胶质细胞成片生长，呈多边不规则形，有细长突起，细胞间连接紧密（图2A）。 图1 GAFP细胞免疫荧光染色观察原代成熟星形胶质细胞（荧光显微镜 400）2.2 缺氧缺糖培养后星形胶质细胞的形态变化 倒置显微镜下：预实验中3 h缺氧缺糖后星形胶质细胞形态未见明显变化；8 h缺氧缺糖后大量星形
3、胶质细胞已出现凝固性坏死。星形胶质细胞经5 h缺氧缺糖后0.5 h时开始出现边缘皱缩，轮廓加强，胞体略增大，细胞质内出现较多颗粒样物质，2 h时形态变化加重，细胞明显肿胀变圆，折光率明显增高，突起增粗缩短，有细胞间紧密连接断裂，少量细胞呈凝固性坏死，8 h时细胞形态变化有所减轻，肿胀的细胞稍缓解，部分坏死细胞已脱落悬浮，细胞数量减少，24 h时肿胀虽继续缓解，但较正常细胞仍有明显肿胀，至48 h时，细胞基本恢复扁平，多边形，有细长突起的正常形态(图2BF)。A：正常组；BF：分别为缺氧缺糖组0.5、2、8、24 h和48 h图2 星形胶质细胞5 h缺氧缺糖后的形态观察（倒置显微镜 200）2.
4、3 RT-PCR检测缺氧缺糖后AQP4 mRNA的表达变化 与正常组（0.780.05）相比，星形胶质细胞AQP4 mRNA在5 h缺氧缺糖后0.5 h时表达先下降（0.470.04，P 0.05），至8 h时明显高于正常并达最高值（1.370.07，P 0.05），24 h时有所下降，但仍高于正常水平(1.250.05,P 0.05）（图3）。 M：DNA标准（DL 2000）；1：正常组；2-6：分别为缺氧缺塘组0.5、2、8、24、48h图3 RT-PCR检测星形胶质细胞5 h缺氧缺糖后AQP4 mRNA的表达变化2.4 免疫荧光检测AQP4蛋白的表达变化 正置荧光显微镜下：AQP4蛋白
5、阳性产物主要分布于细胞膜和细胞质内，呈绿色荧光，细胞核由DAPI染成蓝色荧光。与正常组（0.1610.007）相比，星形胶质细胞AQP4 蛋白在5 h缺氧缺糖后0.5 h时表达先下降（0.1030.009，P 0.05），至8 h时明显高于正常并达最高值（0.2340.009，P 0.05），24 h时有所下降，但仍高于正常水平（0.2110.008，P 0.05）（图4）。A：正常组；BF：缺氧缺糖组0.5、2、8、24 h和48h图4 细胞免疫荧光染色观察星形胶质细胞5 h缺氧缺糖后AQP4蛋白的表达变化（荧光显微镜 200）3 讨论脑水肿是颅脑创伤、脑卒中和颅内肿瘤等许多神经系统疾病共同
6、的病理过程，严重的脑水肿可致患者瘫痪甚至危及生命，但其临床防疗和分子机制的研究都是目前的难题。 AQP4是水通道蛋白家族（已发现10种）中的一种，具有特异的水转运功能。它是存在于脑内的最主要水通道蛋白，在脑内水电解质平衡的调节上发挥着重要作用8, 9。Papadopoulos4和Manley10在细胞毒性脑水肿模型中，研究发现AQP4缺陷小鼠的脑水肿程度明显轻于野生小鼠。但Papadopoulos11和Bloch3在血管源性脑水肿模型和梗阻性脑积水模型中，发现AQP4敲除小鼠的脑水肿程度却明显重于野生小鼠。这说明AQP4在脑水肿的发展和转归过程中均发挥了重要作用，而且可能发挥着双重作用,但目前
7、国内外未见AQP4在星形胶质细胞水肿形成期和消退期整个过程中表达变化的报道。体外缺氧缺糖模型引起了星形胶质细胞明显肿胀、足突和细胞间紧密连接的破坏，它可模拟体内各种神经系统疾病中星形胶质细胞因缺血再灌注损伤引起的脑水肿，并且避开了体内各种复杂的干扰因素，为脑水肿的相关机制研究提供了重要的体外模型。所以本实验分别在缺氧缺糖后星形胶质细胞的形成期和消退期观察AQP4的表达变化，从而探讨AQP4在脑水肿发展及转归过程中发挥的作用。在本实验星形胶质细胞5 h缺氧缺糖模型中：光镜下观察，缺氧缺糖后0.5 h时，细胞肿胀逐渐形成并继续加重，AQP4 mRNA和蛋白的表达较正常组明显降低；在2h时，细胞肿胀
8、加重到顶峰，开始逐渐转为消退，AQP4 mRNA和蛋白的表达反而逐步上升；在8 h时，细胞肿胀虽得有一定程度消退，但肿胀仍很明显，AQP4 mRNA和蛋白表达继续增加，并明显超过正常组达到高峰；至24h时，细胞肿胀进一步消退，水肿形态明显好转，AQP4 mRNA和蛋白的表达开始有所下降；至48 h时，肿胀细胞已基本恢复正常形态，AQP4 mRNA和蛋白的表达也回到正常水平。AQP4介导的细胞内外水份的转运是随着渗透梯度被动转运的12。在缺氧缺糖后星形胶质细胞水肿的形成过程中有能量障碍等许多机制参与，最终出现细胞内外电解质平衡紊乱，伴随细胞内Na+增高，细胞内出现高渗，水分通过AQP4向细胞内高
9、渗方向转移，细胞进入水肿形成期，星形胶质细胞AQP4此时表达下降，可能是细胞保护性地抑制水分的异常内移，以免细胞肿胀过度。恢复正常条件培养后,随着细胞能量障碍等病理因素解除，细胞内外水电介质紊乱逐渐恢复平衡，细胞内高渗状态解除，水分随着渗透梯度变化，通过AQP4介导向细胞外排出，细胞肿胀随即达到高峰并逐渐进入消退期，星形胶质细胞AQP4此时表达升高，可能是保护性促进肿胀细胞内水分的排出。星形胶质细胞细胞内外水电介质逐渐达到平衡后，细胞基本恢复正常形态，细胞不需要AQP4高表达来介导细胞内水分的排出，AQP4表达达到高峰后，逐渐下降至正常水平。总之，在5 h缺氧缺糖培养后星形胶质细胞水肿的整个过
10、程中，AQP4在细胞肿胀形成期表达降低，可能是保护性抑制此时细胞外水分过多地进入细胞内，AQP4在细胞肿胀消退期表达升高，可能是保护性促进肿胀细胞内的水分向外排出，从而尽量使细胞内外达到水电介质平衡，维持细胞正常的形态和功能。参考文献：1 Kimelberg HK. Astrocytic swelling in cerebral ischemia as a possible cause of injury and target for therapyJ. Glia, 2005,50:389-97.2Kitaura H, Tsujita M, Huber VJ, et al. Activity-
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水通道蛋白4在缺氧缺糖后水肿星形胶质细胞中的作用
