pcr(级研究生).11

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1、DNA，生命的蓝图生命的蓝图ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNARNA引物引物RNARNA引物引物PCR技术简史技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCA

2、TCGACGCTGGATCG35GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明n1971年，年，Khorana提出：经过提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆程便可克隆tRNA基因。基因。n但由于测序和引物合成的困难，以但由于测序和引物合成的困难，以及及70年代基因工程技术的发明使克年代基因工程技

3、术的发明使克隆基因成为可能，所以，隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了的设想被人们遗忘了PCR技术简史技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明故事发生在故事发生在1983年年的春夏之交的春夏之交Mullis开车的时候开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面的两条链，自己的车和对面开来的车象是开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA，Mullis的第一个的第一个PCR实验实验n 1983年年9月中旬。月中旬。Kary B.Mullis 1989年美国年美国Science杂志列杂志列PCR 为十余为十余项重大科学

4、发明之首项重大科学发明之首,比喻比喻1989年为年为PCR爆炸爆炸年年,Mullis荣获荣获1993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。由由一对引物一对引物介导介导,通过通过温度的调节温度的调节，使双链，使双链DNA变性变性为单链为单链DNA、单链、单链DNA与引物与引物复性复性（退（退火）成为引物火）成为引物-DNA单链复合物、以及在单链复合物、以及在dNTPs存存在下在下DNA聚合酶使引物延伸而成为双链聚合酶使引物延伸而成为双链DNA（引引物的延伸物的延伸）；这种热变性）；这种热变性-复性复性-延伸的过程，就是延伸的过程，就是一个一个PCR循环；一般通过循环；一般通过2030个循环之后，就

5、可个循环之后，就可获得大量获得大量（106倍倍）的要扩增的的要扩增的DNA片段。片段。又称为无细胞分子克隆技术、基因扩增技术或又称为无细胞分子克隆技术、基因扩增技术或DNA扩增技术。扩增技术。Pg水平至水平至ng水平水平。第一节第一节 PCR基本原理基本原理 一、一、PCR的基本原理的基本原理DNA体外的快速扩增技术体外的快速扩增技术模板DNA95PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1

6、轮结束第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 20第二节、第二节、PCR的过程的过程（一）（一）DNA模板的解链（变性）模板的解链（变性）90 95，30s 理论上，在理论上，在90 左右能使

7、左右能使DNA双链之间双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性中性pH情况下，情况下，DNA的完整性仍能很好保的完整性仍能很好保存。存。（二）（二）DNA 单链与引物的退火（复性）单链与引物的退火（复性）55 65 ,3045s（三）引物的延伸（三）引物的延伸（新链新链DNA的合成的合成）7075，3060s （2kb)首次循环：首次循环：引物从引物从3端开始延伸，延伸片段的端开始延伸，延伸片段的5端为人工合成引物是特定的，端为人工合成引物是特定的，3端没有固定的端没有固定的终止点，长短不一。终止点，长短不一。第二个循环：第二个循环：引物与新链结

8、合，由于后者引物与新链结合，由于后者5端序端序列是固定的末端，列是固定的末端，意味着意味着5端的序列就成为此端的序列就成为此次延伸片段次延伸片段3端的终止点。端的终止点。N个循环后：个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物由于多数扩增产物受到所加引物5端的限定，端的限定，产物的序列是介于两种引物产物的序列是介于两种引物5端之端之间的区域。间的区域。引物本身也是新生引物本身也是新生DNA链的一部分。链的一部分。nSynthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C*A C G-TPolymerase Chain Reaction-PCRSpeci

9、fic short DNA primer anneals to strand to be copied53nSynthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C*A C G T-TPolymerase Chain Reaction-PCR53nSynthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C*A C G T-TAPolymerase Chain Reaction-PCR53nSynthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C*A C

10、G T-TA CPolymerase Chain Reaction-PCR53nSynthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C*A C G T-TA C GPolymerase Chain Reaction-PCR53nSynthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C*A C G T-TA C G TPolymerase Chain Reaction-PCR53nSynthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C*A C G T

11、-TA C G T APolymerase Chain Reaction-PCR53高度的特异性高度的特异性：引物的限定，高温扩增。：引物的限定，高温扩增。高度的敏感性高度的敏感性：微量样品（单拷贝基因、单：微量样品（单拷贝基因、单个细胞、一根头发等），高效性（个细胞、一根头发等），高效性（X106）。）。操作简便快速操作简便快速，易于自动化、程序化，方，易于自动化、程序化，方法稳定。法稳定。对标本的纯度要求底对标本的纯度要求底：纯化或粗制的，新：纯化或粗制的，新鲜或陈旧的，各种细胞，体液，完整的或降解鲜或陈旧的，各种细胞，体液，完整的或降解的的DNA。PCR技术的特点技术的特点特异性强特异性

12、强PCR反应反应的特异性决定因素为：的特异性决定因素为：引物与模板引物与模板DNA特异正确的结合；特异正确的结合；碱基配对原则；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。灵敏度高灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克能将皮克(pg)量级的起始待测模板扩增到微量级的起始待测模板扩增到微克克(g)水平。能从水平。能从100万个细胞中检出一个靶万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达的灵敏度可达3个个RFU(空斑形成单位空斑形成单

13、位)；在细菌学中最小检；在细菌学中最小检出率为出率为3个细菌。个细菌。简便、快速简便、快速PCR反应用耐高温的反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增扩增液和水浴锅上进行变性液和水浴锅上进行变性-退火退火-延伸反应，一延伸反应，一般在般在24 小时小时完成扩增反应。扩增产物一完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。射性污染、易推广。对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总粗制

14、品及总RNA均可作为扩增模板。均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。扩增检测。PCR反应反应第三节、第三节、PCR扩增的基本方法扩增的基本方法（一）（一）PCR反应体系反应体系1.仪器仪器v 台式微量离心机台式微量离心机v 基因扩增仪基因扩增仪v 微量塑料离心管：微量塑料离心管：0.5ml或或1.5ml（经高压灭菌）（经高压灭菌）v 微量加样器（微量加样器（pipetman）：）：20P、200P、1000P，v 电泳仪及电泳槽、紫外摄影装置、乳胶或塑料手电泳仪及电泳

15、槽、紫外摄影装置、乳胶或塑料手套、套、Tip若干若干PCRAgarose gel electrophoresisThe final productUV visualisation3-4 hours2.试剂与试样：试剂与试样：一般选用一般选用50100l体积，体积，模板核酸（模板核酸（如：人基因组如：人基因组DNA 0.1g)扩增引物（扩增引物（一对一对,各各0.21mol/L）TaqDNA聚合酶（聚合酶（2.5U）dNTP（四种：各（四种：各20200mol/L)标准的缓冲液：标准的缓冲液：10X buffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或或DDT）无菌双蒸水或三蒸水无菌双蒸

16、水或三蒸水 石蜡油或矿物油石蜡油或矿物油:3050ul（封闭、防止高温时液（封闭、防止高温时液体的挥发）体的挥发）2.PCR反应试剂反应试剂（1 1）模板）模板单、双链单、双链DNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制聚合酶抑制剂、剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。一般一般100ng DNA模板模板/100 L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度）引物浓度 0.2-1 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异反应特异性下降。性下降。（3）Taq DNA聚合酶聚合

17、酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响酶量过少影响反应产量。反应产量。（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量低则降低反应产量 dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度浓度下降，影响下降，影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmo

18、l/L反应体系。反应体系。Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产产量下降；量下降；Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。浓度。PCR反应体系反应体系 1、10PCR buffer 10l 2、dNTP mix 各各200mol/L 3、引物、引物1 1mol/L 4、引物、引物2 1mol/L 5、DNA模板模板 50ng-1g 6、Taq 酶酶 2U 7、加双蒸水至总体积为加双蒸水至总体积为100l（二）

19、常规（二）常规PCR的反应条件的反应条件 预变性预变性：94 300s（高温起动（高温起动:充分变性，充分变性，防止非特异性扩增）防止非特异性扩增）变性变性：90-95，30s-60s 退火退火：55-65 30s-45s 延伸延伸：70-72 30-60s（5ngn溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察后再观察酶切分析酶切分析n根据根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切相应的酶进行酶切n酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片酶切产物

20、电泳分离后，获得符合理论的片段段n此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究分型，还能进行变异性研究PCR-RFLP分子杂交分子杂交n检测检测PCR产物特异性的有力证据产物特异性的有力证据n检测检测PCR 产物碱基突变的有效方法产物碱基突变的有效方法n主要的杂交主要的杂交 nSouthern印迹杂交印迹杂交n斑点杂交斑点杂交Southern印迹杂交：印迹杂交：n在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记（探针）标记（探针）n与与 PCR 产物杂交产物杂交n此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测此法既可作特异性

21、鉴定，又可以提高检测 PCR产物的灵敏度。产物的灵敏度。斑点杂交：斑点杂交：n将将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上膜薄膜上n寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交n观察有无着色斑点观察有无着色斑点n主要用于主要用于 PCR产物特异性鉴定及变异产物特异性鉴定及变异分析分析RDB检测检测 -地中海贫血突变基因地中海贫血突变基因-29（AG）-28（AG）17（AT，AAG TAG）E（CD26 GAG AAG）IVS-I-1（GT）IVS-I-5（GC）27-28（+C）41-42（-CTTT）43（GT）71-72（+A或或+T）654（CT）微孔板夹心杂交法微孔板

22、夹心杂交法n通过一固定于微孔板的捕获探针与通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物产物的某一区域特异性杂交，使的某一区域特异性杂交，使PCR产物间接地产物间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非固定于微孔板上，然后，再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果区域特异性杂交，漂洗后显色即可判断结果n该法使用了两个杂交过程来检测一个产物，该法使用了两个杂交过程来检测一个产物，其特异性较一次杂交的检测法高其特异性较一次杂交的检测法高Principle：NOS（11014/cm2）N-羟化琥珀酰亚胺酯羟化琥珀酰

23、亚胺酯Principle -CCCCCCCapture Probe:：NH2Detection Probe:：Biotin：NH2标记的探针标记的探针：Biotin标记的探针标记的探针Avidin-HRP 显色系统显色系统：NOS基团基团PrinciplePCR-ELISA法：法：n本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规规ELISA记数仪检测记数仪检测n5端修饰后仍可进行常规端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的引物的5端使其携带便于端使其携带便于PCR产物固定产物固定的功能基团，而通

24、过另一引物的功能基团，而通过另一引物5端的修端的修饰使产物便于检测饰使产物便于检测 Sequence The specific method should be ROBUST Re-optimise for each set of primers第四节第四节 PCR的优化的优化OPTIMISE PCR CONDITIONSX Optimising the PCR ReactionnStarting nucleic acid-DNA/RNATissue,cells,blood,hair root,saliva,semen nThermo-stable DNA polymerasenOligonu

25、cleotides primersnThe concentration of Mg2+in the reactionnThe annealing temperature（一）（一）DNA聚合酶聚合酶(最关键因素之一最关键因素之一)1、Taq-DNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度聚合酶的热稳定性及最适延伸温度 在在7080具有最高聚合活性，高温时仍比较具有最高聚合活性，高温时仍比较 稳定。所以稳定。所以7080为其最适延伸温度，则退为其最适延伸温度，则退 火和延伸反应温度可提高，限制了非特异性扩火和延伸反应温度可提高，限制了非特异性扩 增产物的出现，增加了增产物的出现，增加了PCR的特异性。的特

26、异性。2、Taq-DNA聚合酶的功能聚合酶的功能 有有53聚合酶活性聚合酶活性 有有53外切酶活性外切酶活性 无无35外切酶活性外切酶活性 Taq-DNA聚合酶聚合酶Taq DNA酶的聚合出错率较高酶的聚合出错率较高（2.1X10-4），然而通过优化反应条件，可使），然而通过优化反应条件，可使Taq酶酶的聚合出错率降低到原来的的聚合出错率降低到原来的1/3。若要细胞克隆若要细胞克隆PCR扩增的产物，进行表达，扩扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用。增后必须测序证实才可使用。3、激活剂与抑制剂激活剂与抑制剂Taq-DNA聚合酶聚合酶：其活性需要其活性需要Mg2+。Mg2+的精确浓度主

27、要取决的精确浓度主要取决dNTP浓度浓度Mg2+浓度过高导致非特异扩增。浓度过高导致非特异扩增。一般常用一般常用1.5mmol/L4、其他耐热其他耐热DNA聚合酶聚合酶Tth DNA聚合酶聚合酶（Thermus thermophilus）：在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此在较高的温度下仍具有逆转录酶活性，因此能很好地克服能很好地克服RNA链中普遍存在二级结构的链中普遍存在二级结构的难题。难题。Vent DNA聚合酶：聚合酶：具有校读功能，具有相对较具有校读功能，具有相对较好的高保真性。好的高保真性。Sac DNA聚合酶：聚合酶：FD DNA聚合酶：聚合酶：（二）引物（寡核苷酸引物）（二）

28、引物（寡核苷酸引物）引物：引物：引物是引物是PCR特异性反应的关键特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，序列，就就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。引物的作用：引物的作用：决定决定PCR扩增产物的特异性与长扩增产物的特异性与长度度，决定，决定PCR反应的成败。反应的成败。PCR引物的设计一般原则引物的设计一般原则引物长度引物长度一般以一般以1830b

29、p为宜，过短则降低特异为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。引物间退火温度，同时也增加引物合成的成本。引物间退火温度相差不要超过相差不要超过5。避免引物内部出现避免引物内部出现二级结构二级结构，避免序列内有较长，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和和A/T碱基均匀分布，碱基均匀分布，G+C含量在含量在4060%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。避免出现嘌呤或

30、嘧啶连续排列。Avoid repeat sequences5533no target PCR productPCRhairpin loop formation5-NNNNNNNNNNNGCATGC-35-NNNNNNNNNNNNNNNNN-35-NNNNNNNNNNNGCA 3-CGT53要避免要避免两个引物间特别是两个引物间特别是3末端碱基序列互补末端碱基序列互补以以及同一引物自身及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。不能形成引物二聚体或发卡结构。引物引物3末端碱基一般应与模板末端碱基一般应与模板DNA严格配对严格配对，并，并且且3

31、末端为末端为G、C或或T时引发效率较高。时引发效率较高。引物引物5末端碱基可不与模板末端碱基可不与模板DNA匹配匹配，可添加与，可添加与模板无关的序列模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序如限制性核酸内切酶的识别序列、列、ATG起始密码子或启动子序列等起始密码子或启动子序列等)，便于克，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性不能与非扩增区有同源性。Avoid repeat sequences5 5 3 3 5 5 3 3 primer dimerPCR3 repeat5-NNNNNNNNNNNNNTA

32、TA-35-NNNNNNNNNNNNNTATA-35-NNNNNNNNTATA-3 3-ATATNNNNNNNN-5Avoid repeat sequences5 5 3 3 no extensionPCR5 repeat5-TATANNNNNNNNNNNNN-3 5-TATANNNNNNNNNNNNN-3 5-TATANNNNNNNN-3 3-NNNNNNNNATAT-5 5 5 3 3 其他：其他：简并引物：简并引物：多种寡核苷酸组成的混合物，彼多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。嵌套引物（巢式嵌套引物（巢式PCR）：使使DNA序

33、列得到序列得到有效的选择性扩增。有效的选择性扩增。86Nested PCR:to increase specificityFirst roundprimersFirst roundPCRSecond roundprimersSecond roundPCRGene of interest（三）模板（三）模板 模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与成败与否的关键环节之一。否的关键环节之一。PCR模板制备与纯化模板制备与纯化 PCR模板的来源主要有两大类：模板的来源主要有两大类：纯净物纯净物 如重组质粒、制备的染色体如重组质粒、制备的染色体DNA粗样品粗样品 如粪便、脑脊髓

34、液、血液、食物、土如粪便、脑脊髓液、血液、食物、土壤、尿液、组织切片、脓汁、痰液等壤、尿液、组织切片、脓汁、痰液等。上述粗样品含有大量的上述粗样品含有大量的PCR反应抑制物质，反应抑制物质，因此如何因此如何去除去除这些种类繁多的这些种类繁多的抑制剂抑制剂或者添加或者添加必要的必要的PCR反应反应增强剂增强剂显得十分重要。显得十分重要。PCR模板制备与纯化模板制备与纯化 从各种粗样品中去除从各种粗样品中去除PCR反应抑制剂的反应抑制剂的程序不尽相同，但常用的手段包括：程序不尽相同，但常用的手段包括：样品稀释样品稀释溶剂萃取（氯仿溶剂萃取（氯仿异戊醇异戊醇 491）乙醇沉淀乙醇沉淀高速离心高速离心

35、超滤超滤（四）脱氧三磷酸核苷酸（四）脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs）特异性的改进：特异性的改进：降低降低dNTPs的浓度，但要注意的浓度，但要注意Mg2+的摩尔浓度也应同步降低。的摩尔浓度也应同步降低。有效性的改进：有效性的改进：对于较大分子量的模板，应适当提对于较大分子量的模板，应适当提高高dNTPs的量的量保存：保存：使用时应配成高浓度，小量分装，使用时应配成高浓度，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。降解。使用量：使用量：在在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为20-200umol/L。成分配比：成分配比：注意注意4种种dNTP的浓度要相等。的浓度要

36、相等。(五）五）Mg2+Taq酶活性所必需，酶活性所必需，游离的游离的Mg2+的标准使用范围：的标准使用范围：0.5-10 mM特异性的改进：特异性的改进：降低降低Mg2+浓度，但要注意过低的浓度，但要注意过低的Mg2+浓度又会影响扩增产物的产量。浓度又会影响扩增产物的产量。有效性的改进：有效性的改进：提高提高Mg2+浓度，但过量浓度，但过量Mg2+将导将导致非特异性扩增致非特异性扩增 Mg2+的浓度影响扩增产物的特异性、引物退火的浓度影响扩增产物的特异性、引物退火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，确性。因此，PCR反应系统的主要优

37、化参数是反应系统的主要优化参数是Mg2+的浓度。的浓度。(六）六）PCR的热循环计划的热循环计划PCR反应条件的选择反应条件的选择PCR反应条件为反应条件为温度、时间和循环次数温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：温度与时间的设置：基于基于PCR原理三步骤原理三步骤（DNA变性、引物退火和反应延伸变性、引物退火和反应延伸）而设置变性）而设置变性-退退火火-延伸三个温度点。双链延伸三个温度点。双链DNA在在9095变性，再变性，再迅速冷却至迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，引物退火并结合到靶序列上，然后升温至然后升温至7075，在，在Taq DNA 聚合酶的作用下，聚合酶的作用下

38、，使引物链沿模板延伸。使引物链沿模板延伸。退火杂交温度和时间退火杂交温度和时间退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性特异性的较重要因素的较重要因素特异性的改进：特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温提高退火温度（比建议退火温度提高度提高2-5）；减少退火时间。过长的退火时）；减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非间在正常情况下并不能提高产量，只会增加非特异性引物杂交的可能性特异性引物杂交的可能性。退火温度与时间，取决于退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基引物的长度、碱基组成及其浓度，还有模板的长度组成及其浓度，还有模板的长度。Optimising the An

39、nealing TemperaturenPrimers have a calculated annealing temperature(e.g.54C)nTemperature must be confirmed practicallynTemperature steps of 2C above and belownUse gradient cycler循环次数循环次数 决定决定PCR扩增程度扩增程度 主要取决于模板主要取决于模板DNA的浓度的浓度 选在选在2540次之间次之间 影响的主要因素包括影响的主要因素包括扩增底物（引物和扩增底物（引物和dNTPs）有效浓度的下降）有效浓度的下降非特异

40、性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用反应试剂的稳定性反应试剂的稳定性扩增产物抑制作用扩增产物抑制作用 高浓度产物的退活作用以及不完全变性高浓度产物的退活作用以及不完全变性第五节第五节 PCR中应注意的事项中应注意的事项（一）（一）防止污染防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）二）设立对照设立对照：阳性对照阳性对照：阳性模板阳性模板阴性对照阴性对照：阴性模板阴性模板第六节第六节 PCR技术类型技术类型反向反向PCR 锚定锚定PCR不对称不对称PCR 原

41、位原位PCRRT-PCR 重组重组PCR差异显示差异显示PCR 免疫免疫PCR实时定量实时定量PCR 多重多重PCR1)反向反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片片段对某个段对某个已知已知DNA片段两侧的未知序列片段两侧的未知序列进行扩增。进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的的克隆克隆,扩增基因文库的插入扩增基因文库的插入DNA；建立基因组；建立基因组步移文步移文库。库。已知序列

42、已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶 2）不对称）不对称PCR目的：目的：扩增产生特异长度的扩增产生特异长度的单链单链DNA。方法：方法：采用采用两种不同浓度的引物两种不同浓度的引物。分别称为。分别称为限制性引物和非限制性引物限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般其最佳比例一般是是0.01 0.5M,关键是限制性引物的绝对量。关键是限制性引物的绝对量。用途：用途：制备核酸序列测定的模板制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组DNA结构功能的研究结构功能的研究 3）RTPCR:是以反转录的是以反转录的cDNA作模板所作模板所进行的进

43、行的PCR反应反应,用于测定基因表达的强度用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现呈现mRNA多态性多态性,克隆克隆mRNA的的5和和3末端序末端序列列,以及从非常少量的以及从非常少量的mRNA样品构建大容样品构建大容量的量的cDNA文库。文库。标准的标准的RT-PCR程序包括：程序包括：mRNA的分离的分离cDNA反应的引物退火反应的引物退火mRNA反转录为反转录为cDNAcDNA的的PCR扩增扩增 引物选择有三种战略：引物选择有三种战略：基因特异性引物化，最精确灵敏基因特异性引物化，最精确灵敏寡聚寡聚dT引物化引物化随机六聚体引物化随机六聚体引物

44、化5335 53 RDDP （反转录酶）（反转录酶）引物、引物、4种种dNTP RNase（核酸酶（核酸酶H活性活性)DDDP （DNA聚合酶活性）聚合酶活性）4种种dNTP 35RNARNA-DNA 杂化分子杂化分子 双链双链DNA（cDNA第二链）第二链）35 3 5335 与与RNA互补的互补的DNA(complementaryDNA，cDNA)反转录为反转录为cDNAcDNA原位原位PCR（1990）n以组织固定处理细胞内的以组织固定处理细胞内的DNA 或或RNA 为靶序为靶序列，进行列，进行PCR反应，不必分离模板反应，不必分离模板DNA或或RNA 冷冻的组织、乙醇或冷冻的组织、乙醇

45、或福尔马林固定的组织细胞福尔马林固定的组织细胞板上加板上加PCR 试剂扩增试剂扩增探针原位探针原位杂交杂交蛋白酶蛋白酶 处理处理多重多重PCR（Multi PCR）加入多对引加入多对引物，对同一模板物，对同一模板的若干区域进行的若干区域进行同时扩增。适用同时扩增。适用于绘制真核生物于绘制真核生物庞大基因或基因庞大基因或基因组中的缺失图谱组中的缺失图谱，如分子病的临，如分子病的临床辅助诊断。床辅助诊断。P1P2P3P4P1P2P3P4正常人扩增物正常人扩增物病人扩增物病人扩增物多对引物的组合必须满足二个条件：多对引物的组合必须满足二个条件：将反应条件较为接近的引物组合在一起，将反应条件较为接近的

46、引物组合在一起，以使反应条件尽量适合所有被扩增片段；以使反应条件尽量适合所有被扩增片段；同一反应内各扩增片段的大小应不同，同一反应内各扩增片段的大小应不同，以便检测时能通过电泳将各片段分离开。以便检测时能通过电泳将各片段分离开。锚定锚定PCR（Anchored PCR）AAAAA 3反转录反转录3 GGGGGGGG锚定引物锚定引物锚定锚定PCR又称为又称为 cDNA末端快速末端快速扩增扩增PCR，主要，主要用于用于5端序列未端序列未知的知的cDNA的扩的扩增和克隆。增和克隆。5553TdTdGTP55 CCCCCCCCPCR3 GGGGGGGG5 CCCCCCCC53PCR5 CCCCCCCC

47、5特异性引物特异性引物免疫免疫PCR免疫免疫PCR：结合了结合了PCR扩增体系和以免疫反扩增体系和以免疫反应原理为基础的技术，对扩增产物进行特异应原理为基础的技术，对扩增产物进行特异鉴定和定量分析的反应。鉴定和定量分析的反应。（一）寡核苷酸探针检测系统（一）寡核苷酸探针检测系统（二）（二）RNA探针探针-抗体捕获系统抗体捕获系统寡核苷酸探针检测系统寡核苷酸探针检测系统 此种系统十分灵敏，它能检测微板中约此种系统十分灵敏，它能检测微板中约10pg10pg的生物素的生物素化化PCRPCR产物，并且适合应用于任何靶序列。产物，并且适合应用于任何靶序列。RNA探针探针-抗体捕获系统抗体捕获系统PCR-

48、RFLP：根据突变序列是否位于限制根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对性内切酶的酶切位点内而设计的对PCR产产物作限制性片段长度多态性分析的技术。物作限制性片段长度多态性分析的技术。RFLP：在同种生物不同个体出现不同长度在同种生物不同个体出现不同长度限制性片段类型的现象。限制性片段类型的现象。PCR-限制片段长度多态性限制片段长度多态性114PCR mutagenesis(诱变诱变)PCR can be used to introduce deletion and point mutationsTwo separate PCR reactions are performed

49、.One PCR amplifying the 5-portion of the insert,and the other amplifying the 3-portion of the insert.The point mutation/deletion mutations are located in the primers115SP6 primerT7 primerForward mutagenic primerReverse mutagenic primerFirst PCRRemove primersDenature and annealExtend to full length b

50、y DNA polymerase33116Second PCRSP6 primerT7 primerDNA cloning第七节第七节 PCR技术在临床医学方面的应用技术在临床医学方面的应用PCR检测病原体检测病原体 PCR临床诊断术临床诊断术PCR检测病原体检测病原体 临床上检测病原体通常有三类方法：临床上检测病原体通常有三类方法：相比较而言，相比较而言，PCR检测法在很多情况下不需要检测法在很多情况下不需要培养。这不仅省时，更重要的是很多病原微生物难培养。这不仅省时，更重要的是很多病原微生物难以培养，如某些病毒、真菌厌氧菌、支原体等；以培养，如某些病毒、真菌厌氧菌、支原体等；病原菌和病毒的

51、生物培养富集病原菌和病毒的生物培养富集 病原菌和病毒的抗原免疫检测病原菌和病毒的抗原免疫检测 病原菌和病毒核酸特征序列的病原菌和病毒核酸特征序列的PCR检测检测 PCR检测法比免疫分析法更廉价；检测法比免疫分析法更廉价；PCR检测法可以使用多重引物同时检测若干检测法可以使用多重引物同时检测若干种病原微生物。种病原微生物。PCR检测程序已自动化。检测程序已自动化。PCR临床诊断术临床诊断术 PCR临床疾病诊断术的主要原理有下列几个方面：临床疾病诊断术的主要原理有下列几个方面：检测病变基因的缺失或缺损检测病变基因的缺失或缺损（扩增产物变小或无扩（扩增产物变小或无扩增产物）增产物）检测病变基因的点突

52、变检测病变基因的点突变（扩增产物电泳迁移率改变）（扩增产物电泳迁移率改变）检测病变基因的重排检测病变基因的重排（扩增产物大小改变）（扩增产物大小改变）检测病变检测病变mRNAmRNA的结构的结构（扩增产物大小改变）（扩增产物大小改变）检测染色体易位检测染色体易位（扩增产物大小改变）（扩增产物大小改变）骨髓移植的骨髓移植的PCRPCR指纹图谱快速配型指纹图谱快速配型（随机引物扩增）（随机引物扩增）第八节第八节 常规常规PCR的常见问题及处置措施的常见问题及处置措施 不出现扩增条带（假阴性）不出现扩增条带（假阴性）非特异性扩增产物过多：产物呈非特异性扩增产物过多：产物呈拖尾现象或呈涂布状拖尾现象或

53、呈涂布状 引物二聚体的形成引物二聚体的形成 所有样品均为阳性（假阳性）所有样品均为阳性（假阳性）PCR常见问题之一常见问题之一无扩增产物无扩增产物现象：现象：正对照有条带，正对照有条带，而样品则无而样品则无 模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 BufferBuffer对样品不合适对样品不合适 引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解 退火温度太高，延伸时间太短退火温度太高，延伸时间太短 原原因因PCR常见问题之二常见问题之二 非特异性扩增 现象：现象：1 1）PCRPCR扩增后出现的条带与预计的扩增后出现的条带与预计的大小不一致；大小不一致；2 2）或者同时出现特异性扩增带

54、与非）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。特异性扩增带。1)1)引物特异性差引物特异性差,2)2)模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高 3)3)酶量过多酶量过多 4)Mg4)Mg2+2+浓度偏高浓度偏高 5)5)退火温度偏低退火温度偏低 6)6)循环次数过多循环次数过多 原原因因 非特异性扩增PCR常见问题之三常见问题之三 拖尾拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态 M 1 21)1)模板不纯或降解模板不纯或降解2)Buffer2)Buffer不合适不合适3)3)退火温度偏低退火温度偏低4)4)酶量过多酶量过多5)dNTP5)dNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓

55、度偏高6)6)循环次数过多循环次数过多 原原因因 拖尾PCR常见问题之四常见问题之四 假阳性假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物假阳性 操作时防止将操作时防止将靶序列靶序列吸入加样枪内或吸入加样枪内或 溅出离心管外；溅出离心管外；2)2)除不能耐高温的物质外，所有试剂器材除不能耐高温的物质外，所有试剂器材 均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。3)3)各种试剂先进行分装，低温贮存。各种试剂先进行分装，低温贮存。对对策策9.1 污染原因污染原因(1)模板间交叉污染模板间交叉污染(2)PCR试剂污染试剂污染(3)实验室中克隆质粒的污染实验室中克隆质粒的污染第九节第九节 PCR污染污染9.2 防止污染的方法防止污染的方法(1)合理分隔实验室合理分隔实验室(2)移液枪不能接触移液枪不能接触PCR相关试剂相关试剂(3)手套、吸头、小离心管一次性使用手套、吸头、小离心管一次性使用(4)设阳性和阴性对照，重复实验设阳性和阴性对照，重复实验130 结束语结束语