植物雌激素葛根素 大豆苷元对人成骨样细胞MG-63的作用及相关分子机制的研究

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1、lIlIII I III III III III 11111目录Y1 901 591中文摘要l英文摘要4英文缩写7研究论文植物雌激素葛根素、大豆苷元对人成骨样细胞MG63的 作用及有关分子机制的研究珥-莉舌9材料与措施12成果33附图42附表79讨论81结论86参照文献87综述白细胞介素6与绝经后骨质疏松症的研究进展92道谢104个人简历：105中文摘要植物雌激素葛根素、大豆苷元对人成骨样细胞MG63 的作用及有关分子机制的研究摘要目的：研究已证明异黄酮类化合物葛根素(puerarin)和大豆苷元 (daidzein)对去卵巢大鼠具有明显的抗骨质疏松活性，并可以明显增进原代 培养的大鼠成骨细胞

2、增殖和分化。奉室前期工作已证明葛根素能剂量依赖 性增进大鼠成骨样细胞增殖，克制体外破骨细胞性骨吸取功能并在体外促 进小鼠长骨生长，但有关两种植物雌激素对人成骨细胞作用及作用机制的 研究尚未见报道。本工作在文献报道和前期研究的基本上，以人成骨样细 胞MG63为研究模型，观测了葛根素和大豆苷元对人成骨细胞增殖、分化、存活、骨吸取调节因子如骨保护素(osteoprotegerin，OPG)NFrd3激活 受体配体(receptor activator of NFrd3 ligand，RANKL)NFr,t3激活受体( receptor activator ofNF1cB，RANK)系统、白介素6(i

3、nterleukin6，IL6) 及其受体体现的作用，并对其也许的作用机制进行了初步探讨。措施：1MTT法观测葛根素和大豆苷元对人成骨样细胞MG63细胞的增殖能力的影响。2引用流式细胞术分析葛根素和大豆苷元对MG63细胞细胞周期分布的影响。3磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。4DAPI染色法观测葛根素和大豆苷元对顺铂诱导的细胞凋亡能力的影响。5。逆转录聚合酶链式反映(reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR)检测OPG、RANKL、IL6及其受体(儿6Ra、gpl30)、ER

4、a、 ERD、凋亡克制蛋白BclxL和X染色体连锁的凋亡克制蛋白(X1inked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)mRNA的体现水平。6酶联免疫吸附实验(enzyme1inked immnosorbent assay，ELISA)法检测IL6蛋白的体现水平和I型胶原酶的含量。7免疫印迹(Western Blot)技术检测OPG、RANKL、IL6Ra、gP 130、中文摘要ERa和ERl3蛋白的体现水平。8应用雌激素受体(estrogen receptor,ER)阻断剂ICI 1 82，780观测ER在 葛根素和大豆苷元调节成骨细胞上述生物学性能中的作用

5、。9采用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)分别对MG63细胞的 雌激素受体(estrogen receptor，ER)0【和ERl3基因进行沉默，G418筛 选出阳性单克隆，扩大培养后用Western Blot技术分别鉴定出ERa或 ERD高、中克制体现克隆用于拟定ER亚型在介导两种植物雌激素调节 成骨细胞上述生物学性能中的作用。10应用Western Blot技术及特异性信号阻断剂PD98059(K12阻断剂)和Wortmannin(P13K阻断剂)分析两种植物雌激素对成骨细胞发挥作 用的有关信号通路。成果： l葛根素和大豆苷元均可明显增进人成骨样MG63细胞增殖，

6、进一步研究发现两种植物雌激素可使Gl期细胞比例减少，G2+S期细胞比例增加。2葛根素和大豆苷元可通过增长MG63细胞中ALP活性和I型胶原含量 增进成骨细胞分化成熟。3葛根素和大豆苷元均可明显克制由顺铂诱导的MG63细胞发生凋亡， 进一步研究发现两种植物雌激素可上调MG63细胞中XIAP和BclxL 的mRNA体现。4葛根素和大豆苷元均明显上调MG63细胞中OPG的mRNA及蛋白表达，同步下调RAI，的mRNA及蛋白水平。5ER阻断剂ICI 182，780可部分阻断葛根素和大豆苷元对MG63细胞的 上述作用，其中葛根素对MG63细胞的增殖和分化是由ERa和ERB 共同介导；大豆苷元对MG63细

7、胞的增殖是重要由ERa介导，其分化 是由ERa和ERl3共同介导；两种植物雌激素对MG63细胞IL6产生 重要是由ERa介导。6葛根素和大豆苷元均能上调成骨细胞中ERa和ERl3的mRNA和蛋白 体现水平；大豆苷元对成骨细胞中两种ER亚型体现水平的作用强于葛 根素。7葛根素能上调MG63细胞中ERK和Akt的磷酸化体现水平；大豆苷中文摘要元仅上调MG63细胞中ERK的磷酸化水平，对成骨细胞中Akt的磷酸化体现水平作用不明显。8 PD98059明显阻断葛根素和大豆苷元诱导的促成骨细胞增殖和分化作 用；Wortmannin仅能阻断葛根素诱导的成骨细胞上述作用，对大豆苷 元作用不明显。9 Wortm

8、annin可明显阻断两种植物雌激素对成骨细胞中IL6的作用， PD98059对两种植物雌激素诱导成骨细胞的上述作用效果不明显。结论：1葛根素、大豆苷元对人成骨细胞的增殖、分化及OPG体既有明显的促 进作用，对RANKL和IL6体现则有一定的克制作用，此外两种植物 雌激素还具有抗成骨细胞凋亡的功能。2葛根素和大豆苷元均可部分经由ER途径对成骨细胞发挥上述作用，其 巾葛根素对成骨细胞的增殖和分化是由ERa和ERl3共同介导；大豆苷 元对成骨细胞的增殖是重要由ERa介导，其分化是由ERa和ERl3共l司介导；两种植物雌激素对成骨细胞IL6产生重要是由ERa介导。此外，两种植物雌激素均能上调成骨细胞中

9、ERa和ERl3的体现水平，其 中大豆苷元的作用强于葛根素。3葛根素和大豆苷元对成骨细胞的促增殖作用也许与其调控细胞周期分 布，虽然G1期细胞比例减少，G2+S期细胞比例增长有关；对成骨细 胞的抗凋亡作用也许与其上调抗凋亡制蛋白XIAP和BclxL的体既有 关。葛根素和大豆苷元对成骨细胞的促增殖、分化及克制IL6产生的 作用也许至少通过活化RaS小匝划ERK和P13弛Al(t通路来实现的。核心词：葛根素；大豆苷元；骨保护素；NFr,B激活受体配体；白细 胞介素。6；雌激素受体；有丝分裂原激活的蛋白激酶英文摘要The effect and molecular mechanism of puera

10、rin and daidzeinon human osteoblast1ike ceiIline MG63ABSTRACTobjectives：Our room based on our previous studies have confirmed that puerarin and daidzein has significant proliferation activity and differentiation function Oil ovariectomized ratsIn this experiment,further study the effect ofpuerarin a

11、nd daidzein on human osteoblast1ike cell line MG63，includeproliferative activity,differentiation function，antiapoptosis activities，the expression(R觚)receptorof osteoprotegerin(OPG)the receptor activator of NF1cB ligand activator of NFlcB，(RANK)system，the expression ofinterleukin一6(IL一6)and itsrecept

12、or,alsoexplore possible molecularmechanism of puerarin and daidzeinMethods：11Th,ee proliferation activityactivity assayY withwith MTTMTT method2Cell cycle assay with flow cytometry3Alkaline phosphatase(ALP)activity assay with colorimetric method and collagen synthesis were examined by enzyme1inked i

13、mmnosorbent assay(ELISA)4 DAPI staining was performed to abserve the effects of puerarin and daidzein on the cisplatin-induced apoptosis of MG63 cells5The expression levels of OPG,RANKL，IL6，IL6 receptor(IL6Ra, gp l 30)，apoptosis inhibitory protein(BclxL)and X1inked inhibitor of apoptosis(xtAP)mRNAwe

14、re detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)6 The expression level of IL一6 protein Was detected by enzyme1inkedimmnosorbent assay7 111e expression levels of OPG；RANKL，IL-6Ra，gp l 3 0，Phospho-p4442mitogen activated protein kinase(P-p4442脚K)，mitogen activated protein kinase沁K

15、)，PhosphoAkt and Akt protein were detected by一_4英文摘要 Western Blot8 Using RNA interference(RNAi)technology for estrogen receptor-a(ER叻，estrogen receptor-13Rp)of MG一63 to conduct gene silencing，G4 1 8 screened for positive monoclonM expansion of cultured，then using Westem Blot identification to choose

16、 ERofERl3 high and medium inhibit expression clones for exploring the affinity of puerarin and daidzein to ERa and ERl39 mitogen activated protein kinase(MAPK)specific antagonist to explore the signaling pathways related the effect of puerarin and daidzeinResults：1 The effect of puerarin and daidzei

17、n on Biology nature of humanosteoblast-like cell line MG63Puerarin and daidzein could markedly promote MG一63 cell proliferation, also advanced cell growth by altering cell cycle distribution，it made MG63 cells a significant decrease in the G1 phase and increase in the G2+S phase Puerarin and daidzei

18、n stimulated cell differentiation through promoting the activities of ALP of MG63 cellPuerarin and daidzein opposed cisplatininduced apoptosis in MG一63 cells，further study found that puerarin or daidzein up-regulated apoptosis inhibitory proteinAP and BclxL expression in MG一63 cellsPuerarin and daid

19、zein could markedly up-regulated mRNA and protein levels of OPG in dosedependent manner of MG一63 cells，down-regulated R ANKI，mRNA and protein expression levels，LC could inhibit the expression of IL6 mRNA and protein of MG63 cells；itdaidzein had depressant effect on IL一6Ra or gp l 30 mRNA and protein

20、 expression； puerarin had no effect on both transcriptional and protein expression levels ofIL-6Ra or gpl302 The molecular mechanism of puerarin and daidzein on humanosteoblastEstrogen receptor(ER)antagonist ICI1 82780(Brand name：Fulvestrant) could abolish the effect of puerarin and daidzein on huma

21、n osteoblast，it indicated that puerarin and daidzein affect on osteoblast through estrogen receptorsThe effect of puerarin and daidzein on the clones of super-inhibit5英文摘要ERa expression and super-inhibit ERl3 expression had no significant difference， SO its affinity to ERa and ERp were similar,ERa a

22、nd ERl3 both mediated the effect of puerarin and daidzeinwhile MAPK specific antagonist PD98059 (ERK inhibitors)、P13K specific antagonist Wortmannin(Al(t inhibitors)couldpartly block the effect of puerarin，but P13K specific antagonist could not block the effect of daidzeinsuggesting that the effect

23、of puerarin and daidzein on human osteoblast also depended on non-Genomic mechanism(MAPK signaling pathway)Conclusions：1 puerarin and daidzein could stimulate human osteoblast proliferation anddifferemiation，also advance cell growth by altering cell cycle distribution2 puerarin and daidzein could pr

24、omote the expression of OPG and decreasethe expression of RANKL and IL一6 of osteoblast3 The Effect of puerarin and daidzem on osteoblast through estrogen receptors，and it had no selectivity between ERa and ERp4 puerarin and daidzein play its role in osteoblast through activating EREmeans and MAPK pa

25、thwayKey words：Puerarin；Daidzein；OPG；RANKL；IL-6；ER；MAPK6英文缩写英文缩写AbbreviationFull English NameChineseALPalkaline phosphatase碱性磷酸酶Ampampicillin氨苄青霉素AP1activator protein一1激活蛋白1APSammolomium persulfate过硫酸胺BSAbovine serum albumin牛血清白蛋白CDNAcomplementary DNA互补DNADMSodimathyl sulfoxide二甲基亚砜EBethidium bromid

26、e溴化乙锭EDTAethylenediamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸二钠ERestrogen receptor雌激素受体EREEstrogen responsive element雌激素反映元件ERKExtracellular signal regulated细胞外信号调节激酶kinaseELISAenzymelinked immnosorbent酶联免疫吸附实验assayFBSfetal bovine serum胎牛血清HEPEShydroxyethyl piperazine羟乙基哌嗪乙磺酸ethanesulfonic acidHRPhorSeradish pero

27、xidise辣根过氧化物酶IL6Interleukine6白细胞介素6IL6RInterleukine一6 Receptor白细胞介素6受体胀Janus kinase蛋白酪氨酸激酶胍Jun N-terminal kinaseJun氨基末端激酶M匕廿Kmitogen activated protein kinase细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶3一(4，5-Dimethylthiazol 2 y1)2，5一di四甲基偶氮唑盐phenyltetrazolium bromideNFKBnuclear factor kappa B核因子心7英文缩写NFIL6nuclear factor IL-6IL

28、6核因子ODoptical density光密度ONPGortho-nitrophenyl-beta-D-galactopy 邻硝基苯-pD一半乳糖苷ranosidePAGEpolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate buffered saline磷酸盐缓冲液p-ERKphosphoERK磷酸化ERKPIPropidium iodide碘化丙啶P13Kphosphatidylinositol一3 kinase磷脂酰肌醇3激酶PMSFphenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物PVDFpolyvini

29、lidene difluofide聚乙烯二氟RT-PCRReverse transcription polymefise逆转录聚合酶链式反映chain reactionSDSsodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠STAT3Signal transducer and activator of信号转导子及转录激活 transcfiption-3子3TBSI ris buffered boric acid saline三羟甲基氨基甲烷硼酸缓冲盐溶液TBSTTBStween20TBS吐温20缓冲盐嘶strishydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷TE匝D

30、N，N，N，N-tetramethylethy-lenedia四甲基乙二胺mineWestern Blot蛋白质免疫印迹法8研究论文植物雌激素葛根素、大豆苷元对人成骨样细胞MG63 的作用及有关分子机制的研究JL刖昌骨质疏松症是影响老年人健康及生活质量的严重问题。随着人类社会 的老龄化，60岁以上群体中至少有l4的人患有不同限度的骨质疏松症， 更为严重的是骨质疏松症患者的骨骼由于矿物质大量丢失而变得异常脆 弱，稍有疏忽极易发生多发性骨折。骨组织是通过成骨细胞和破骨细胞的耦联活动完毕自我更新和重建。 在正常生理状态下骨吸取和骨形成保持甲衡，而绝经后妇女雌激素水甲的 下降导致骨转换率加速，骨吸取不

31、小于骨形成，从而发生骨量丢失导致骨质 疏松症。雌激素通过骨组织上的雌激素受体(estrogen receptor,ER)介导 调节骨代谢，同步妇女绝经后雌激素水平减低可导致ER数量和功能下降 fl】o雌激素是通过ER来介导成骨细胞的增殖、分化，基质的沉积、矿化， 机械应力适应性应答及基质蛋白的合成作用。雌激素通过与成骨细胞内的 ER相结合，促使其分泌胶原酶，释放细胞因子及生长因子等发挥骨形成 作用。此外，雌激素还可通过克制成骨细胞凋亡，延长其生命期，从而对 其呈现保护作用12卅。近来研究表白，雌激素对破骨细胞的作用重要受成 骨细胞的分泌产物问接调节，涉及骨保护素(osteoprotegerin

32、，OPG)、NFrd3激活受体配体(the receptor activator of NFrd3 ligand，RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor,MCSF)，它们调 节破骨细胞前体分化为破骨细胞，并调节成熟的破骨细胞活性及其凋亡的 速度。雌激素通过成骨细胞间质细胞上具有转录活性的ERa增进OPG生 成，减少MCSF分泌。近年来，细胞因子与绝经后骨质疏松症的关系越来 越受关注，大量的研究表白白细胞介素6(interleukine6，IL6)在PMOP 发病机制中发挥了极其重要作用【5。7】，雌激素至少有部分是通过克制儿6

33、 等细胞因子的产生，制止破骨细胞形成而发挥其抗骨质疏松活性的。大量的临床和实验研究已证明雌激素替代治疗(estrogen replacementtherapy,ERT)对绝经后骨质疏松防治效果肯定，但同步也增长了心血管研究论文疾病的相对风险，长期应用可引起患乳腺癌和子宫内膜癌瞵J。因此，寻找 防治绝经后骨质疏松症有效而副作用小的抱负药物，是目前研究的热点和 难点。天然雌激素是指由人或哺乳动物分泌的一种具有18个碳原子的甾体 化合物，它的合成和分泌受腺垂体分泌的促性腺激素支配和调控。相对于 腺体分泌的天然雌激素，人们把外界存在的雌激素或雌激素样化合物统称 为外源性雌激素(xerogenous e

34、strogen)。按其来源，外源性雌激素有3类：人工合成的雌激素、环境中雌激素样化合物和植物雌激素。前两种雌激素可在环境中长期存在，对人及动物有危害；而后者具有毒性小，易提取和 药理活性广泛等特点，从而在过去十年中，备受学者关注。植物雌激素主 要可分为三大类，即黄酮类、香豆素类和芪类；其中对黄酮类植物雌激素 的研究较为进一步。黄酮类植物雌激涉及黄酮(Flavone)和异黄酮 (Isoflavone)两类构造，其中异黄酮类植物雌激素是一类空间构造与1713 雌二醇(17Destradiol，E2)、己烯雌酚及选择性雌激素受体调节齐lj(Selective Estrogen Receptor Mo

35、dulators，SERMs)_三苯氧胺相类似的杂环酚类化合 物，活性只有E2的10一100倍，是一种弱雌激素，能在内源性雌激素水平 低时体现出弱雌激素活性，在内源性雌激素水平高时，还能与内源性E2 竞争结合ER而显示出抗雌激素活性【121。异黄酮类植物雌激素在某些组织 中起雌激素激动作用，而在另某些组织中起雌激素拮抗作用，具有与选择性雌激素受体调节剂(SEIWs)相类似的组织选择性【9】。流行病学、实验 研究和临床资料表白，异黄酮类化合物像SERMs样，对子宫有抗增殖作 用，而对脂蛋白和骨密度则产生有益影响，有学者称之为天然SERMs。在过去十年中，大豆异黄酮的抗骨质疏松作用被广泛关注，其中

36、大豆 苷元(daidzein)对妇女更年期综合症和绝经后骨质丢失有一定的避免作用 91。有文献报道，大豆苷元可克制去卵巢大鼠骨丢失【I卅：明显提高去卵巢大 鼠的骨密度【lu；大豆苷元可以增长鼠成骨细胞的蛋白质合成及碱性磷酸酶 的活性【121。异黄酮类化合物葛根素(puerarin)是葛根的重要活性成分，具有减少血压，减慢心率，扩张血管的作用，临床上用于高血压、心绞痛、脑供血局限性和脑梗塞的治疗f131。葛根素与大豆苷元构造极其相似，仅在8一 位相差一糖基，故推断其具有与大豆苷元相类似的骨代谢调节能力。研究论文葛根素(Puerarin)大豆苷元(Daidzein) 本室前期实验表白，葛根素能剂量

37、依赖性增进成骨样细胞株UMRl06细胞的增殖和分化；对体外破骨细胞性骨吸取功能具明显克制作用，能使 体外破骨细胞性骨吸取陷窝数目和吸取陷窝表面积呈剂量依赖性减少：并 且在体外能增进小鼠长骨生长，加速软骨内成骨，减少骨化区破骨细胞数， 增长肥大区软骨细胞数，同步能剂量依赖性地上调软骨骺板肥大区中ERa 的体现及增殖区ERl3的体现。提示其对骨也许具有雌激素样活性，也许 具有与异黄酮类植物雌激素相似的作用特点f14】。但有关两种植物雌激素对 人成骨细胞作用及作用机制的研究尚未见报道。本研究在文献报道和前期 工作的基本上，以人成骨细胞系MG63为细胞模型，该细胞具有特性性成 骨细胞功能【1516】，

38、并同步表j2生ERtxYfI：IERl3t15，l 71，观测葛根素和大豆苷元对 人成骨细胞增殖、分化、凋亡及其产生的骨吸取调节因子如骨保护素OPG、 RANKL和IL6体现的作用，初探其作用机制及有关信号转导通路。本研 究成果将为探讨植物雌激素对成骨细胞的作用机制以及临床应用植物雌 激素治疗骨质疏松症提供根据，从而为开发高效低副作用的新型抗骨质疏 松药物提供理论指引。研究论文材料与措施1材料11细胞系人成骨肉瘤细胞(MG63)：美国ATCC公司产品，购自武汉大学中国 典型培养物保藏中心。12药物葛根素、大豆苷元购自中国药物生物制品检定所，雷洛昔芬 (Raloxifene，Ral)和雌二醇为美

39、国Sigma公司产品。13质粒pGenesilERasiRNA、pGenesil-ERl3一siRNA、pGenesil-scramblesiRNA 三种质粒由武汉晶赛生物科技公司设计合成，均以pGenesil1为载体，该 载体带有CMV启动子，是可以体现增强型绿色荧光蛋白的真核体现载体。三种质粒的Sense+Loop+Antisense DNA模板序列如下：Sense：CTCATCCTCTCCCACATCApGenesilERa-siRNALoop：TTCAAGACGAntisense：TGATGTGGGAGAGGATGAG Sense：GCCCTGCTGTGATGAATTApGenesil

40、ERpsiRNALoop：TTCAAGACGAntisense：TA ATTCATCACAGCAGGGC Sense：GACTTCpdA AGGCGCATGCpGenesil-scramble-siRNA Loop：TTCAAGACGAntisense：GCATGC GCCTTATGAAGTC14试剂141细胞培养有关试剂DMEM高糖培养基美国GIBCO公司 DMEM无酚红高糖培养基天润善达生物科技公司 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)兰州民海生物科技公司 胰蛋白酶北京鼎国生物科技公司EDTA美国Sigma公司研究论文HEPES美国Sigma公司DMSO天润善达生物科技

41、公司青链霉素混合液南京凯基生物科技公司 其她：氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠(Na2HP04-12H20)、磷酸二氢钾、 碳酸氢钠均为分析纯国产试剂142检测细胞增殖活性有关试剂MTT美国Sigma公司盐酸与异丙醇均为分析纯国产试剂 143流式细胞仪检测有关试剂PI美国Sigma公司RNase北京天根生物科技公司144细胞体外凋亡能力检测有关试剂DAPI瑞士Roche公司顺铂澳大利亚Mayne Pharma公司145测定ALP活性有关试剂Triton X100北京天根生物科技公司ALP活性检测试剂盒南京建成生物工程公司 146RT-PCR有关试剂Trizol Reagent美国lnvitrogen

42、公司d NTP Mixture大连宝生物公司Oligo Primcr大连宝生物公司RNaseA北京天根生物科技公司 M小V Reverse Transcriptase美国Promega公司 无酶水北京天根生物科技公司6Loading Buffer(D604) 北京天根生物科技公司 1 00bp DNA Ladder Marker 北京天根生物科技公司 2xPCR Mixture 大连宝生物公司琼脂糖美国Promega公司引物南京金思特科技公司引物序列如下：OPG研究论文一一-一一一上游：5GCTAACCTCACCTTCGAG 3下游：5TGATTGGACCTGGTTACC 3扩增产物长度：32

43、3 bp 退火温度：55 R ANKI，：上游：5AACAGGCCTTTCAAGGAGCTGTGC 3下游：5AAGAGGACAGACTCACTTTf町GGG 3扩增产物长度：200 bp退火温度：55IL6：上游：5CTTTTGGATTT()AGGTATACCTAC3。下游：5GCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGTC3扩增产物长度：200 bp 退火温度：60 IL6Ra：上游：5。AGGTGGCGAGAGGCGTGCTGAC 3下游：5CA=rCCACCAGCAAGTGCACAGT 3扩增产物长度：249 bp退火温度：55ERot上游：5ACACTGTGTTCAACTACCCC

44、GAG 3。下游：5lCAGGCTGTTGGGACTGAAGG 3扩增产物长度：200 bp退火温度：55ERl3-上游：5TCTGTCCAGCCACGAATCAG 3下游：5AGCTTTTACGCCGGTTCTTG 3扩增产物长度：200 bp退火温度：49SRCl：上游：5CCACCCCTGA ATGCTCAA ATGT 3研究论文下游：5CTGCTCCTGGAlrACTGGAAGAC 3扩增产物长度：403 bp退火温度：55SRC2：上游：5CATGTTTTCCCAGCAGTCCCCA 3下游：5CTGCTCGGGACCCATGGAGGAC 3扩增产物长度：199 bp 退火温度：55

45、 SRC3：上游：5GGACAGGCATTAGAGCCCAAACA 3下游：5CTGCTGGCCCTGCAGCCTCTGCT 3扩增产物长度：294 bp 退火温度：55 BclxL：上游：5ATGTCTCAGAGCAACCGGGAGC 3下游：5。GCGATCCGACTCACCAATACCT 3扩增产物长度：500 bp退火温度：59IAP：上游：5ATGAIACCATCTTCCAAAATCC 3下游：5TTTCTGTAATGAAGTCTGACTT 3扩增产物长度：200 bp退火温度：55 13-actm：上游：5TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3下游：5TA AAACG

46、CAGCTCAGTAACAGTCC3扩增产物长度：350 bp退火温度：55147 Western Blot有关试剂碱s北京鼎国生物科技公司BCA蛋白定量试剂盒美国Pierce公司15研究论文过硫酸铵北京鼎国生物科技公司高蛋白脱脂高钙奶粉伊集团牛血清白蛋白(BSA)科锐思公司 化学发光底物检测试剂盒美国Pierce公司 蛋白Marker美国NEB公司十二烷基硫酸钠(SDS)、NP40、去氧胆酸钠、PMSF、Aprotin、HEPES、 TEMED、Acrylamide、BIS(甲叉双丙烯酰胺)、甘氨酸Glycine、溴 酚蓝、Tween20、p一巯基乙醇均为美国Sigma公司产品抗体见下表：N

47、ameSourceProducerDilution0PGMouseSanta Cruzl：200Monoclonal AbRANKI，MouseSanta Cruzl：200Monoclonal AbIL6RaRabbitSanta Cruz1：200 polyclone Abgpl30RabbitSanta Cruzl：500 polyclone Ab一_ERaRabbitSanta Cruz1：200 polyclone AbERl3RabbitSanta Cruz1：200polyclone AbSRC1RabbitCell Signal1：1000 polyclone AbP-p444

48、2MouseCell Signal1：MAPK(T202204)Monoclonal AbERKlMouseCell Signal1：5000Monoclonal AbP拙RabbitCell Signal1：1000polycione Ab研究论文AktRabbitCell Signal1：1000 polyclone AbIB-actinMouseSigma USA1：Monoclonal AbAnti-Rabbit IgGGoat polycloneKPL USA1：5000(H+L)Ab，AbHRPconjugatedAnti-Mouse IgGGoat polycloneKPL US

49、Al：5000(H十L)Ab，AbHRPconj ugated148细菌培养及质粒提取有关试剂酵母提取物美国GIBCO公司胰化蛋白胨美国GIBCO公司 质粒DNA小量纯化试剂盒北京天根生物工程公司 氨苄青霉素美国Sigma公司149细胞转染有关试剂脂质体lipofectin美国invitrogen公司OPTI-MEM美国GIBCo公司CaCl22H20美国AMRESCO公司141 O荧光素酶检测有关试剂ONPG美国Sigma公司荧光素酶检测试剂盒美国Promega公司 1411其她试剂ICll82780美国Sigma公司G418北京鼎国生物科技公司人IL6 ELISA Kit美国RD公司产品

50、SB90、SP600125、PD98059均为美国Calbiochem公司产品1412重要试剂的配制 高糖DMEM培养基：取一包密封的高糖DMEM干粉，先溶于300 ml三蒸水，按照包装阐明书加入2O g碳酸氢钠、2O g HEPES，用适量三蒸研究论文水冲洗包装袋和容器瓶壁，匀速搅拌使之充足溶解，用三蒸水定容到1 L，并调节pH值为7274，用O22 Inn微孔滤膜过滤除菌，4保存。D-HankS平衡盐溶液：精密称取8 g NaCl、04 g KCI、O06 g Na2HP04H20、O06 g KH2P04、O35 g NaHC03、O02 g酚红溶于1 L纯 水，调节D-HankS液pH

51、值至72-一74，分装于盐水瓶内高压灭菌， 4 保存。混合消化液：称取1 g EDTA溶于100 ml D-HankS液，用1NNaOH 调节pH至8O使其完全溶解，配成1EDTA。然后量取1EDTA 10 ml，称取胰蛋白酶O25 g溶于500ml D-HankS液，用O22岬微孔滤膜过滤除菌，10 lIll分装，20保存。O01M PBS-将8 g NaCl、02 g KCl、144 g Na2HP04、O44 g KH2P04 溶解于800 ml蒸馏水中，用1N HCl和1NNaOH调节pH值为74，加水 至1000 ml，4。C保存。05mgml MTT精密称取0。5 g MTT粉溶于

52、1L灭菌PBS平衡盐溶液， 振荡使其充足溶解，10蹦分装于青霉素小瓶，并用锡箔纸包裹，20保 存。DAPI stock液：精密称取5 mg DAPI溶于l nd经高压灭菌的纯水中， 过滤、分装，20保存。5xTBE缓冲盐溶液：精密称取54 g Tris、275 g H3803溶于800 ml 纯水，加入05M的EDTA溶液20瑚，用1N HCl和1NNaOH调节pH值 为83，加水至1000 ml，4。C保存。RIPA细胞裂解缓冲液：精密量取3 ml 5M的NaCl、1 ml NP40、1 ml 10的SDS、5 ml pH 80的1M TrisHCl，并称取O5 g去氧胆酸钠混合， 用纯水定

53、容至100 ml即为RIPA不完全裂解液，放入棕色瓶中，4。C保存 备用。临用前分别按照与RIPA不完全裂解液为1：100的比例加入100 mM 的PMSF(异丙醇溶解)和1：125的比率加入10 mgrni的Aprotin(O01M 的舾PES溶解)。5xWestern Blot电泳缓冲液：精密称取151 g Tris、94 g Glycine、5 g SDS溶于1 L纯水，振荡使其充足混匀，4。C冰箱保存备用，使用时按照 1：4的比例加入纯水稀释。10x膜转移电泳缓冲液(贮存液)：精密称取3028 g Tris、14413 g18研究论文Glycine溶于1 L纯水，振荡使其充足混匀，4。

54、C冰箱保存备用，使用前3 h， 取10x膜转移电泳液20 ml、甲醇40 Inl，加纯水定容到200 ml，于20 保存备用(以不结冰为宜)。Tris Buffer saline(1 xTBS)：精密量取10 ml pH 80的1M Tris-HCl、 30 ml 5M NaCl，纯水定容至l L，充足混匀放于4备用；于l L TBS溶 液中加入O5砷的Tween20既得TBST缓冲盐溶液；称取5 g脱脂奶粉 溶于100 ml TBST缓冲盐溶液，充足混匀既得5封闭缓冲液。Stripping Membrane缓冲盐溶液：精密量取625 ml pH68的1M 嘶s-HCl、20 ml 10的SD

55、S，加纯水定容到100 ml充足混匀，室温保存。 使用时取出20越，再加入150 lal p巯基乙醇。12琼脂糖凝胶：称取12 g琼脂粉溶于45 m1纯水，加入5 ml 5xTBE， 于微波炉内加热至琼脂粉完全溶解，呈溶液，于室温冷却至60后再加 入6 m EB至终浓度为O5 ggml，倒板制胶，室温凝固即可。2M CaCl2溶液：精密称取CaCl22H20 147 g，三蒸水定容至50 nll，过滤除菌，20保存。2xHEPES Buffer Saline(2HBS)：精密称取NaCl16 g， Na2HP042H20 O027 g，HEPES 12 g，三蒸水定容至100 ml，NaOH调

56、PH 至705，过滤除菌，20保存。10 mM ONPG底物溶液：精密称取ONPG O301 g，三蒸水定容至100 ml，4。C保存。LB培养基：精密称取Tryptone 10 g，Yeast Extract 5 g，NaCl 10 g， 三蒸水定容至1000 ml，NaOH调PH至7O，高压火菌，4保存。 15重要实验设备AL型电子天平Mettler ToledoIX71倒置式研究型显微镜OIYN癣US IX71 F22FLPH型荧光倒置式显微镜0I YN伊US 216K型低温离心机美国Sigma公司SW-CJ1F医用型干净工作台苏州安泰空气技术公司LDZX40BI自动电热压力蒸汽灭菌器上

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