医学免疫学实验指导

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1、医学免疫学实验指导病原生物与免疫学教研室实验一免疫系统组织和细胞形态学一、实验目的观察小鼠胸腺、脾脏等免疫器官及免疫细胞二、实验内容机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。该系统具有识别和排除抗原性 异物、维持机体内环境稳定和生理平衡的功能，是执行体液免疫和细胞免疫的物质基础。 本次实验主要观察免疫器官大体解剖学、免疫细胞的形态学特征。小鼠是啮齿目中体形较小 的动物，淋巴系统很发达，包括胸腺、脾脏、淋巴管、外周淋巴结及肠道派氏集合淋巴结。 本实验在带教老师指导下，解剖小鼠，观察胸腺、脾脏等免疫器官，并制血涂片，观察小鼠 免疫细胞。（一）小鼠免疫器官解剖学观察【材料】1动物：昆明种小白鼠

2、。2 试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液。3 器材：眼科镊，眼科剪，玻片。【方法】1 小鼠脱臼处死，投入盛有3%来苏尔水的缸内，浸泡5分钟。取出小鼠，仰卧位置 于试验台上，使动物腹部朝上。2以镊子提起耻骨处皮肤，用剪刀沿正中线直剪开至下颌部，然后钝性分离皮肤，再 把皮肤向四肢剪开。3 注意观察腹壁，用剪刀沿正中线自阴部至膈肌为止剪开，观察腹腔液量及性状，观察脾 脏。4 切开膈肌，剪断胸骨，翻起胸骨，观察胸腺、心脏及肺脏，胸腺位于小鼠胸腔心脏前上 方，内有许多大淋巴细胞（即前胸腺细胞）及特定的上皮网状细胞（分泌胸腺激素）。5 解剖结束，深埋动物。（二）免疫细胞的形态观察【材料】1动物：昆明种小白鼠。

3、2 试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液，pH8.6硫酸盐缓冲液，20%盐酸甲醇。3 器材：眼科镊，眼科剪，玻片。【方法】1准备洁净玻片两张，一张用于推片，另一张用于固定标本。2 剪断小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血，迅速在玻片上涂血膜制备血涂片，自然干燥。3 瑞氏染色（1）染色：甲醇固定标本2分钟（亦可省略），滴加瑞氏染液数滴覆盖血膜，染色1分 钟，再加等量的pH8.6硫酸盐缓冲液或新制蒸馏水，用洗耳球吹打，使之与染液混匀，静置 染色810分钟，弃去染料，水洗。（2）脱色：用20%盐酸甲醇脱色，肉眼观察玻片呈粉红色为宜，显微镜下观察结果。4 细胞特征T细胞：T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成的，是淋巴

4、细胞中数量最多、功能最复杂 的一类细胞，占外周血液淋巴细胞总数的75%80%。T细胞体积较小，胞质少，核呈圆形， 常在一侧有小凹陷，染色质呈块状，较致密，故着色较深。多数T细胞寿命较长，可存活数 月至数年或更长。在抗原刺激下，T细胞经过多次分裂增殖，形成效应性T细胞。效应性T 细胞的存活期短，具有杀伤靶细胞的能力，但必须与靶细胞结合才能产生免疫效应。B细胞：B细胞由骨髓中的淋巴干细胞分化而成，占血中淋巴细胞总数的10%15%，数量 较少。细胞体积比T淋巴细胞略大。B细胞的结构，在光镜下与T细胞难以区别。B细胞生 存期一般较短，可存活数周或数月，也有寿命长达数年的。当B细胞受到抗原刺激后，增殖

5、分化为大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体（免疫球蛋白），抗体在血液中循环。通过抗 体与抗原结合，可中和毒素，抑制细菌或靶细胞的代谢，溶解靶细胞，从而清除相应抗原并 促进巨噬细胞吞噬抗原。NK细胞：自然杀伤细胞，由骨髓中淋巴干细胞分化而来，占血中淋巴细胞总数的2%5%， 在人体内分布广泛，以外周血和脾、淋巴结中NK细胞活性最高。在中空器官的管壁固有层 和一些实质性器官的间质中，均有NK胞存在。在骨髓中NK细胞活性较低。NK细胞是大 淋巴细胞，平均直径为1215pm，胞质较多，在胞质内有许多大小不等的嗜天青颗粒，故 又称大颗粒淋巴细胞，核呈卵圆形。NK细胞不需抗原激活，更不需抗体的协助，它可直接

6、杀伤靶细胞，例如杀伤被病毒感染的细胞和肿瘤细胞，NK细胞的这种抗感染和抗肿瘤的杀 伤作用是广谱的。DC：树突状细胞，是一类形状不规则的非单核吞噬系统细胞，特点是胞浆有许多长突起呈 触须状，使整个细胞的形态像一个蜘蛛。树突状细胞分散于全身的上皮组织和实质性器官， 其细胞数量不超过局部细胞总数的1%；也可迁移到血液和淋巴，其数量不超过血液有核细 胞总数的0.1%。树突状细胞的吞噬能力较弱，但细胞表面积大，且有丰富的4HCII类分子， 所以捕获抗原和递呈抗原的能力很强。单核巨噬细胞：单核细胞发生于骨髓的多能干细胞，循环于血液中，穿透血管内皮进入组织 内，转变为巨噬细胞。单核吞噬细胞系统在体内分布广，

7、细胞数量多，主要分布于疏松结缔 组织、肝、脾、淋巴结、骨髓、脑、肺以及腹膜等处，并依其所在组织的不同而有不同的名 称。单核细胞一般为圆形，直径约1020pm ；巨噬细胞大小不等，直径约1030pm或更 大，常有伪足，呈多形性。单核巨噬细胞有肾形或马蹄形的核，胞浆中富含溶 酶体及其他各种细胞器。中性粒细胞：占白细胞总数的50%70%，是白细胞中数量最多的一种细胞。细胞呈球形， 直径1012pm，核染色质呈团块状。核的形态多样，有的呈腊肠状，称杆状核；有的呈分 叶状，叶间有细丝相连，称分叶核。细胞核一般为5叶，正常人以23叶者居多。中性粒 细胞的胞质染成粉红色，含有许多细小的淡紫色及淡红色颗粒，颗

8、粒可分为嗜天青颗粒和特 殊颗粒两种。嗜天青颗粒较少，呈紫色，约占颗粒总数的20%，光镜下着色略深，体积较大。 特殊颗粒数量多，淡红色，约占颗粒总数的80%，颗粒较小，直径0.30.4pm，呈哑铃形或 椭圆形，内含碱性磷酸酶、吞噬素、溶菌酶等。吞噬素具有杀菌作用，溶菌酶能溶解细菌表 面的糖蛋白。中性粒细胞具有活跃的变形运动和吞噬功能。嗜酸性粒细胞：占白细胞总数的0.5%3%。细胞呈球形，直径1015pm，核常为2叶，胞 质内充满粗大（直径0.51.0pm）、均匀、略带折光性的嗜酸性颗粒，染成桔红色。电镜下， 颗粒多呈椭圆形，有膜包被，内含颗粒状基质和方形或长方形晶体。颗粒含有酸性磷酸酶、 芳基硫

9、酸酯酶、过氧化物酶和组胺酶等，因此它也是一种溶酶体。嗜酸性粒细胞也能做变形 运动，并具有趋化性。它能吞噬抗原抗体复合物，释放组胺酶灭活组胺，从而减弱过敏反应。 嗜酸性粒细胞还能借助抗体与某些寄生虫表面结合，释放颗粒内物质，杀灭寄生虫。故嗜酸 性粒细胞具有抗过敏和抗寄生虫作用。嗜碱性粒细胞：数量最少，占白细胞总数的015%。细胞呈球形，直径1012pm。胞核分叶呈S形或不规则形，着色较浅。胞质内含有嗜碱性颗粒，大小不等，分布不均，染 成蓝紫色，可覆盖在核上，颗粒具有异染性，甲苯胺蓝染色呈紫红色。.红细胞与血小板：红细胞直径78.5pm，呈双凹圆盘状，中央较薄，周缘较厚，故在血涂 片标本中呈中央染

10、色较浅、周缘染色较深。血小板是骨髓中巨核细胞胞质脱落下来的小块， 故无细胞核，表面有完整的细胞膜。血小板体积甚小，直径24pm，呈双凸扁盘状；当受 到机械或化学刺激时，则伸出突起，呈不规则形。在血涂片中，血小板常呈多角形，聚集成 群。血小板中央部分有蓝紫色的颗粒，称颗粒区；周边部呈均质浅蓝色，称透明区。实验二、小鼠血脑屏障观察一、实验目的1、掌握血脑屏障验证实验的操作过程2、了解血脑屏障的作用二、实验内容血脑屏障是机体的屏障结构的重要组成部分。血脑屏障主要由软脑膜、脉络丛、脑毛 细血管和星状胶质细胞构成。该组织结构致密，病原菌及其它大分子物质不易通过，故能 保护中枢神经系统。婴幼儿因血脑屏障尚

11、未发育完善，故较易发生脑膜炎等中枢神经系 统感染。【材料】1动物：昆明种小白鼠。2 试剂：5%的台盼蓝水溶液，无菌生理盐水。3 器材：眼科镊，眼科剪，剪刀。【方法】1将5%的台盼蓝水溶液经尾静脉分别注入两只小白鼠体内，每只0.7mL，其中一 只颅内注射无菌生理盐水0.1mL。2 510分钟后观察小白鼠皮肤、眼、嘴等的颜色变化。3 于306 0分钟后，见小白鼠眼、嘴呈蓝色，即窒息死亡，腹部朝下固定。4由头部到尾部沿背中线剪开皮肤，暴露皮下、肌肉和内脏，观察颜色变化。5小心剖开颅骨椎管，暴露脑和脊髓，与皮下、肌肉和内脏相比，并比较两只小鼠有 何不同。实验三、吞噬细胞功能检测一、实验目的掌握吞噬细胞

12、功能测试的操作过程及意义二、实验内容体内具有吞噬功能的细胞群按其形态的大小分两类：一类为大吞噬细胞，即组织中的巨噬 细胞和血液中的大单核细胞。它们对异物有吞噬和消化的功能，在机体非特异性免疫、特异 性免疫和免疫调节中有重要的作用，因此，通过测定吞噬细胞的吞噬作用可判断机体的免疫 力。另一类为小吞噬细胞，即中性粒细胞。中性粒细胞的功能包括粘附、移动、吞噬杀菌等， 是机体天然免疫力的重要组成部分。（一）中性粒细胞吞噬功能的测定【材料】1试剂：白色葡萄球菌，肝素溶液，甲醇，碱性美蓝染液。2 器材：血红蛋白吸管，凹玻片，载玻片，1mL注射器及26号针头，采血针，酒精棉球 等。【方法】1菌液的制备将白色

13、葡萄球菌接种于肉汤培养基中，放37C温箱内培养12 h左右；置100C水浴中 加热10min，杀死细菌，用无菌生理盐水稀释成每毫升6x108个细菌备用。2 试验方法用血红蛋白吸管吸取受试者耳垂或指40uL，立即加入盛有20uL肝素（浓度为20U/m L）的洁净凹玻片的凹孔内，轻轻搅动混匀，再加上述葡萄球菌菌液20u L充分混匀。 然后置入铺有湿纱布的有盖容器内（此容器先放37C温箱中预温），在37 C温箱中作用 30min，其间每隔10min摇匀一次。作用完毕，取1小滴混合液置于洁净无油污的载玻片一 端，推成薄片。待干后，用甲醇固定45min，碱性美蓝液染23min，置油镜下观察。随 机计数1

14、00个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的白细胞数，对有吞噬作用的白细胞， 应同时记录所吞噬的细菌数。3 结果表示方法（1）吞噬细胞（%）:即100个中性粒细胞中吞噬有细菌的细胞数；（2）吞噬指数：将100个中性粒细胞所吞噬的细菌总数除以100，得到每个白细胞吞噬细菌 的平均数，即为吞噬指数。4临床应用一般多用于病人治疗前后白细胞吞噬指数与百分率的动态变化，作为观察疗效和判断预后的 参考指标。【注意事项】本法可清楚地观察到中性粒细胞的清理作用，但作为科研指标，客观性差，不宜采用。（二）巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验【材料】1动物：昆明种小白鼠。2 试剂：1 %鸡血球，2%面粉或淀粉肉汤，瑞特氏染液

15、。3 器材：无菌注射器及针头，玻片。【体内方法】1于实验24小时前，在小鼠腹腔内注射1mL淀粉肉汤。2 次日重复注入淀粉肉汤1mL，经过1小时后再给小鼠腹腔内注入1%鸡血球悬液 1mL。3 血球注射后1小时，用注射器抽取小鼠腹腔渗出液做涂片，自然干燥后，进行瑞氏 染色(方法同前)。4用油镜观察巨噬细胞浆内有无被吞噬的鸡红细胞，并进行计数。5结果：(1) 吞噬百分率：油镜下观察100个巨噬细胞，计算吞噬百分率，以表示吞噬细胞的吞 噬功能。正常值为60%左右。(2) 吞噬指数。按下列公式算出吞噬指数(即每个吞噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数)： 吞噬指数= 100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞总数/100

16、(3) 吞噬鸡红细胞的等级观察：借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能，1级表示吞噬功 能，ii、m、w级表示消化功能强弱。I级：被吞噬的鸡红细胞完整，未消化，胞浆浅红或浅黄带绿色，胞浆浅紫红色。II级：轻度消化，胞浆浅黄绿色，核固缩，染成紫蓝色。mi级：重度消化，胞浆淡染，胞核呈浅灰黄色。IV级：完全消化，巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。【注意事项】鸡红细胞呈橄榄球形，有清楚的细胞核，亦呈橄榄球形，染色后清晰可见，容易与小白 鼠的红细胞相区别。本实验的观察指标是吞噬百分率、吞噬指数，这两个指标是主观指 标，客观性差。实验四、红细胞粘附功能测定一、实验目的掌握红细胞粘

17、附功能测定的方法及意义二、实验内容（一）花环法测定红细胞CD35分子红细胞膜上C3b受体（CD35）可与补体致敏的酵母菌粘附形成花环（RBCC3bR花环）； 红细胞膜上粘附的IC中C3b分子可与未致敏的酵母菌粘附形成花环（RBCIC花环）。 RBCC3bR和RBCIC花环率可作为红细胞免疫粘附功能的指标，如二项指标都低下，判 为原发性红细胞免疫功能低下，为红细胞膜C3b受体受到破坏和影响所致；如果RBCC3b R花环率降低，而RBCIC花环率增高，为继发性红细胞免疫功能低下，是由于CIC增加， 红细胞粘附IC过多引起的。此两项试验可作为临床上免疫性疾病的疗效及预后检测指标，亦 可作为器官移植、

18、疾病发病机理与药物筛选的红细胞免疫指标，以及用于中医中药作用的免 疫学研究。【材料】1动物：昆明种小白鼠。2 试剂：肝素，生理盐水，酵母菌，0.25%戊二醛。3器材：离心机，细胞计数板，二层定性滤纸，光学显微镜，试管，水浴箱，玻片。【方法】1制备待测红细胞悬液：将肝素抗凝的血用生理盐水洗涤离心3次，2000 r/min离心3 5min，计数后配成1x108m L红细胞悬液备用。2酵母菌培养：取酵母菌菌种接种于沙保培养基，28培养24 h即可。3制备补体致敏的酵母菌悬液：将酵母菌用生理盐水洗涤3次后，配成1 %悬液，水浴内 煮沸20min，充分混匀。用二层定性滤纸（或16层纱布）过滤，除去小凝块

19、，在低倍镜下呈 单个酵母菌细胞分散状态，加等量小白鼠血清，混匀后置37C水浴致敏15min。用生理盐水 洗涤1次，2500 r /min离心10min。去尽上清，用生理盐水重混悬。计数后配x10&mL补 体（C3）致敏的酵母菌悬液。4 取两支小试管，每管加待测红细胞悬液100uL，第一管再加补体致敏酵母菌悬液 100uL，第二管加未致敏的酵母菌悬液100uL，摇匀放37C水浴30min；取出用手腕轻轻摇匀， 加生理盐水200uL；混匀后，再加0.25%戊二醛75uL轻轻混匀；分别取1 /3量水平涂片，吹干， 加甲醇固定；用瑞氏法染色，油镜下计数。5 红细胞上粘附2个或2个以上酵母菌者为花环。分

20、别计数200个红细胞，算出花环阳性细 胞百分率。第一管为RBCC3b受体花环率，第二管为RBCIC花环率。【注意事项】1酵母菌要分散不能自凝，要充分吹打分散。2 水浴时防止红细胞破坏。3 细胞计数要准确，红细胞与酵母菌比例要合适。（二）红细胞对肿瘤细胞免疫粘附能力的测定肿瘤细胞可通过旁路途径激活并粘附补体，与红细胞C3b受体结合，红细胞还可识别肿瘤 抗原与肿瘤细胞粘附，攻击癌细胞，形成花环状。这为研究肿瘤病人红细胞与血清中补体样 物质共同歼灭肿瘤细胞能力的变化规律及机理提供了有力的手段。【材料】1动物：昆明种小白鼠。1 试剂：0.25%戊二醛，生理盐水，肿瘤细胞。2 器材：试管，玻片，吸管，离

21、心机，水浴箱，100uL加样器。【方法】1 靶细胞准备：靶细胞为肿瘤细胞，经生理盐水洗涤一次，1000 r/min离心1 0 min后， 配成1x106/m L悬液。2制备新鲜血清和待测红细胞悬液：小鼠眼球取血，其中一只取出的血置于加了肝素的试 管中，然后水平离心、2000 r/10min后，取上清即为小鼠新鲜血清；另一只取出的血直接置于 试管中，用生理盐水洗涤3次（每次水平离心2000 r/5min），制备成1x108/mL待测红细胞 悬液。3 测红细胞免疫粘附活性，采用“直向肿瘤红细胞花环实验”：取小鼠新鲜血清100uL加肿 瘤细胞悬液100uL混匀，放37C水浴30min；用生理盐水洗涤

22、一次，水平离心2 0 0 0 r/5min 后，加待测红细胞悬液50uL混匀，放37C水浴30min；取出叮00uL生理盐水混匀后，再加 0.25%戊二醛50u L混匀，水平涂片，瑞氏染色。肿瘤细胞呈蓝色，红细胞呈红色，肿瘤细胞 粘附上3个或3个以上红细胞者为花环，计数100个癌细胞，算出花环率。【注意事项】1计数细胞时要准确，红细胞与肿瘤细胞比例要合适。2 水浴时避免水致红细胞破坏。3 戊二醛加入前后都应轻轻混合，避免假花环出现。实验五、凝集反应一、实验目的掌握凝集反应的原理及常用方法二、实验内容【原理及意义】颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体特异性结合，在适当的电解质环境中形成肉眼 可见

23、的凝集块的现象，称为凝集反应。包括直接凝集反应（细菌或细胞等颗粒性抗原与相应 抗体直接反应出现的凝集现象）和间接凝集反应（将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表 面，再与相应抗体发生反应出现的凝集现象）。凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗 原性质的分析。（一）直接凝集反应（1）玻片凝集反应鉴定细菌【材料】1试剂：1 : 10稀释的伤寒杆菌诊断血清，伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养 物，生理盐水。2 器材：玻璃蜡笔，载玻片，毛细吸管。【方法】1取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用接种环于1、2格 内加1 : 10稀释伤寒杆菌诊断血清12滴，第三格加12滴生理盐水。2

24、无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再混于第一格中（不能先混于第一格再混于第三格，因为这样将使诊断血清混入盐水而影响对照结果），将 细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。 3同法取痢疾杆菌培养物少许，于第二格内混匀。4 轻轻摇动玻片，经12分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即为阳性反应；仍 为乳浊液者，即为阴性反应。（2）玻片凝集反应鉴定ABO血型ABO血型系统可分为四种血型：A型、B型、AB型和O型ABO血型系统中有A、B 两种凝集原，红细胞膜上含A凝集原者称为A型血，含B凝集原者称为B型血，同时含 A、B两种凝集原者称为AB型血

25、，无A、B凝集原者称为。型血。同时，在人类血清中含 有与上述凝集原相对应的天然凝集素，即抗体ABO血型鉴定是用已知的标准A型血清（含 B凝集素）和B型血清（含A凝集素），分别与被鉴定人的红细胞相混合，依其发生凝集反 应的结果判定被鉴定人红细胞表面所含的凝集原而确定的。在正常情况下，ABO血型系统 中只有相同血型的人才能进行输血，仅在无法得到同型血液的特殊情况下，才可考虑将。型 血输给其他血型的人，而且限定在300mL以内，并且应缓慢输入。【材料】1 试剂：标准A血清，标准B血清，酒精棉球，无菌干棉球。2器材：玻璃蜡笔，载玻片，采血针，毛细吸管。【方法】1取清洁玻片一张，用蜡笔划为二格，注明号码

26、，并分别滴加标准A血清和标准B血 清各一滴。2 无菌操作下，用采血针收集受试者耳垂或指端外周血0.51mL。3 分别滴加受试者外周血一滴。4 轻轻摇动玻片，经12分钟后肉眼观察。如两者均凝集则为AB型血，均不凝集 则为O型血，A标准血清凝集而B标准血清不凝集则为A型血，A标准血清不凝集而B 标准血清凝集则为B型血。（3）试管凝集反应【材料】1 试剂：1 : 10稀释的伤寒诊断血清，菌液（伤寒杆菌“H”菌液，伤寒杆菌“O”菌液）， 生理盐水。2器材：试管架，小试管，吸管，玻璃蜡笔。【方法】1取洁净小试管14只分两排排列于试管架上，每排7只依次用蜡笔注明号码，于每 管中分别加入0.5mL生理盐水。

27、2 在第1排第1管中加入1 : 10稀释伤寒杆菌“H”血清0.5mL，再加入生理盐水0.5mL于管内, 连续吹吸3次，使血清与盐水充分混合，而后吸出0.5mL*入第2管，同样再加入生理盐水 0.5mL于管内予以混匀后吸出0.5mL入第3管。依次类推，稀释到第6管，自第6管吸出0.5mL 弃去。此时，自第1管至第6管的血清稀释倍数依次为1 ： 20，1 ： 40，1 ： 80，1 ： 160，1 : 320，1 : 640。第7管不加血清作为对照。3同法用吸管吸取1 : 10稀释伤寒杆菌“O”血清加入第2排第1管，并依次如上法予以稀释。 4用移液管吸取伤寒杆菌“H”菌液0.5mL分别加入第1排各

28、管中，此时血清稀释倍数又增加 了一倍。5同法于第2排各管中分别加入伤寒杆菌“ O ”菌液0.5mL。6将各管振荡混匀，放37C水浴箱中24小时或37 孵育箱中过夜次日取出观察 结果。【观察结果】1观察之前切勿摇动试管，以免凝集块分散。2 先观察对照管，此管应无凝集现象，管内液体仍成混浊状态。但如放置时间较长， 细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。3试验管应自第1管观察起，如有凝集时则于管底有不同大小的圆片状边缘不整齐 的凝集物，上液则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用“+”号表示如下： + + + +”凝集很强，管内液体完全澄清，凝集块完全沉于管底；+ + +”凝集强，管内液体不完全澄清，

29、稍有轻度混浊，凝集块沉于管底；“+”凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底；“+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底；“一”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。4 最后轻轻振荡各管，观察凝集块的状态，对照管的细菌在振荡时呈烟雾状上升，随 即消散，细菌分散仍呈混浊状态。“H”菌液的凝集块疏松呈棉状，大片沉于管底，轻摇即 升起，并极易破碎。“O”菌液凝集呈紧密颗粒状，沉于管底坚实致密，轻轻振摇不易升起， 凝集颗粒较小不易摇碎。5 记录观察的结果并判定凝集效价，通常以能产生明显凝集（ + + ）的血清最大稀释倍数 作为该血清的凝集效价。如血清的最低稀释度（即第1管1 :40）仍无凝集

30、，应报该血 清效价低于1 :40。如血清的最高稀释度（即第6管1 : 1280）仍显完全凝集现象，应报该血 清效价高于1 : 1280。（二）间接凝集抑制试验【原理及意义】若使可溶性抗原与相应抗体先充分反应再加入有关的免疫微球，因抗体已被可溶性抗原结 合，不再出现免疫微球的被动凝集现象，叫间接凝集抑制试验，临床化验检查中常用的免疫 妊娠试验就是一种间接凝集抑制试验。妊娠试验：孕妇尿中绒毛膜促性腺激素（HCG）的含量比正常尿中的高。妊娠尿中加入抗 绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反应的结果，抗体被消耗，此时再往尿中加入 乳胶抗原（吸附有人类绒毛膜促性腺激素的乳胶颗粒），不再发生反应，抗原

31、仍呈乳状液体， 即为妊娠试验阳性。反之，被检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入 的抗体消耗，当乳胶抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反应，出现均匀细小颗粒，妊娠试 验为阴性。【材料】1试剂：吸附有人类绒毛膜促性腺激素的乳胶抗原，抗人类绒毛膜促性腺激素抗体 血清，孕妇尿，正常尿。2器材：黑反应板，玻璃蜡笔，滴管。【方法】1取清洁玻片一张，用蜡笔划为二格，注明号码，并分别滴加妊娠尿和正常尿各一 滴。2分别滴加含抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清各一滴，轻轻摇动，充分混匀。3 分别滴加一滴乳胶抗原，缓慢摇动35分钟，观察结果：不出现凝集者为阳性，其 尿中含有HCG，表示妊娠；出现凝集者为

32、阴性，其尿中不含有HCG，表示未妊娠。【注意事项】1试验材料、用具使用前使其温度接近室温（20C左右）。2 被检尿太混浊，需要过滤。3 尿中有蛋白及血液时，不宜进行此试验。实验六、酶联免疫吸附试验一、实验目的1、掌握酶联免疫吸附试验（ELISA）的基本原理2、熟悉酶联免疫吸附试验（ELISA）的操作过程二、实验内容酶联免疫吸附试验（ELISA），是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶 对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的试验技术。它具有较好的特异性，易观 察结果，便于大规模检测。将已知抗原或抗体，吸附在固相载体微孔聚苯乙烯塑料板上，通 过抗原抗体特异性结合吸附待检样品中的

33、抗体或抗原后，加酶标抗体（酶与抗体或抗原结合 后，既不改变抗体或抗原的免疫反应的特异性，又不影响酶本身的活性）和底物后，在相应 酶底物的作用下生成有色物质，其颜色深浅与标记物中相应的抗体或抗原的含量成正比，由 此即可测定抗原或抗体的含量。常用的有ELISA双抗体夹心法（测抗原）和ELISA间接法（测 抗体）两种。ELISA夹心法测定抗原（HBsAg）常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。【一步法】将图中的第2步和第3步同时进行，允许混合加入，其形成的免疫复合物，基本不影 响目测的结果，适用于目测结果。【二步法】如图中第2步和第3步由于分步进行，其结果较准确，主要用于需要定量检测时。【材

34、料】1 试剂：HBsAg诊断试剂盒。2 器材：酶联仪，微量加样器，吸头等。【方法】1 加样：每组7微孔，待检4孔，空白对照1孔，阴、阳性对照各1孔。分别加阴、阳 性对照1滴和50u L待测样本于相应孔内，置37 水浴箱温育30分钟。2加酶：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板，置37C水浴箱温育30 分钟。3 洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后 一次在吸水纸上拍干。4 显色：每孔加底物液A.B#1滴（50uL），轻拍混匀，置7C水浴15分钟，肉眼观察。5 终止：每孔加终止液1滴（50uL），轻拍混匀。6 测定：用酶标仪（450nm）测定各孔吸

35、光度OD值（先用空白孔校零），P/N值M1者判 为HBsAg阳性，2.1者判为阴性。实验七、流式细胞仪对人T淋巴细胞亚 群的分析一、实验目的了解流式细胞仪使用原理及意义二、实验内容流式细胞仪（FCM）又名荧光激活细胞分类仪（FACS），是集现代电子物理技术、激 光技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体的先 进科学仪器，具有对细胞分析和分选的功能。（1）流式细胞仪的细胞分析原理：将待测样品 制成单细胞悬液，经荧光色素（常用异硫氰酸荧光色素，FITC）染色后，在气体压力的推 动下进入充满鞘液的流动室，在鞘液的约束下细胞排成单列从50100pm的喷嘴逐个高速喷 出

36、，并被鞘液包绕形成细胞液柱。当细胞通过激光束检测区时，细胞被激光束照射发出荧光 和散射光，这些光信号被光敏元件接收后转换成电信号，经计算机分析和处理可得到细胞的 多种信息参数。（2）流式细胞仪的细胞分选原理：细胞的分选是通过流束形成含有细胞的带 电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装备有一个超声振荡压晶体片，充电后高速振动，使喷 出的液流断裂为均匀的小液滴（小液滴是在对细胞的荧光和散射光被测量后形成的）。这时 给流束一个充电脉冲信号，使整个小液滴充以正负不同的电荷。当带有不同电荷的细胞液流 经一对带正、负几千伏恒定静电电场的偏转板时，带电的小液滴就根据自身所带的电荷性质 产生偏转，落入各自的收集容

37、器中，不带电荷的液滴就进入中间的废液容器中，从而实现了 细胞的分选，纯度可达99%以上，对分选出的细胞可做进一步的研究。流式细胞仪具有多参 数性、准确性、快速性及分选的高纯度性等特点，因此在免疫学、细胞生物学、肿瘤学、病 理学、药物学及临床医学等领域中应用非常广泛。尤其在免疫学方面，结合单克隆抗体技术， 在免疫分型分选、肿瘤细胞的免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面更能起到重 要作用，成为现代免疫技术的重要组成部分。现以利用流式细胞仪的细胞分析功能进行人T 淋巴细胞亚群的分析为例。【材料】1 试剂：肝素抗凝血0.4mL，1 : 1000稀释的CD单克隆抗彳 CD3、CD4、CD8, F

38、ITC一羊抗鼠I gG，正常小鼠IgG，细胞洗液，红细胞溶解液，固定液。2 器材：流式细胞仪，试管，吸管，离心机等。【方法】1取4支试管分别加0.1mL素抗凝血。在其中3支试管中分别加CD3、CD4、CD8单克隆 抗体各0.赤1作为试验管；在第4支试管中加等量正常小鼠用6作为对照管。置30 温箱， 45min。2 加入细胞洗液3mL，1000 r/min离心2min，反复2次，洗去未结合的抗体。3 摇匀管底沉淀细胞，加入0.1mLFITC 一羊抗鼠IgG，置30C温箱，45min。4 加入红细胞溶解液3mL，见红细胞悬液变为真溶液时，立即1000 r/min离心2min。5 弃去上清液，离心洗

39、涤2次，恢复体积至0.5mL。6 加入固定液20uL，上机检测。流式细胞仪工作原理示意图【注意事项】1流式细胞仪要求单个细胞通过测量区，对细胞逐个地进行分析，所以制成的单个细胞悬 液样品，不能有细胞团块和过多的细胞碎片，因此离心过程中时间不宜过长，次数不宜过多， 以免形成细胞凝块。2加入试剂后或离心洗涤时，切忌用力吹打或剧烈振摇。3 全部操作尽可能避光，以免荧光衰减。4 样品制备好以后，最好立即上机检测。实验八细胞凋亡的检测一、实验目的熟悉细胞凋亡常用的检测方法二、实验内容细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式。其发生诱因及形态学特 征均有别于坏死，与人类免疫系统的

40、发生发展、神经组织发育、器官的形成、肿瘤的发生发 展等诸多生物学现象之间有着密切联系，并且是免疫应答过程中免疫细胞的杀伤机制之一。 细胞凋亡的检测技术已成为免疫学检测的一个重要内容。凋亡细胞具有典型的形态学、生物 化学及分子生物学变化，从这些特点出发发展起来的检测方法有形态学鉴定、电泳法、免疫 学方法、流式细胞术、原位末端转移酶标记技术、靶细胞DNA片段的定量等。（一）放线菌酮制备大鼠淋巴细胞凋亡模型【原理及意义】放线菌酮（CHX ）是一种蛋白合成抑制剂，可诱导小鼠和大鼠的脾、粘膜免疫系统及 淋巴结的淋巴细胞发生凋亡。此实验旨在体外研究淋巴细胞凋亡的生物学特征。【材料】1 动物：昆明种小白鼠，

41、大鼠。2 试剂：PBS缓冲的4%多聚甲醛或2.5%的戊二醛，放线菌酮（用PBS或生理盐水配成 1mg/mL的浓度，除菌过滤，4C冰箱保存）。3 器材：眼科镊，眼科剪，剪刀，玻片。【方法】1 大鼠用乙醚麻醉后，从腹腔（静脉或皮下）给大鼠注射3mg/kg体重C HX。2 注射2h后，取大鼠脾脏（肠或子宫亦可）等组织，剪成一定大小的组织块，固定于 固定液中。3 固定组织经HE染色作光镜检查或电镜检查。【结果】一般在注射后不久就可在脾及其它粘膜免疫系统出现大量凋亡的淋巴细胞（以B淋巴细胞为 主）。经HE染色后在光学显微镜下细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单 个散在分布，表现为核染色质致密

42、浓缩，核碎裂等。坏死组织则呈均质红染的无结构物质， 核染色消失。【注意事项】由于机体内巨噬细胞对凋亡细胞的清除作用，凋亡细胞形成的高峰期在3h左右，在5h后组织 内凋亡细胞已经很少，所以取材最好不要超过4h。另外，放线菌酮的剂量要控制在25mg/kg 体重。制备成功的模型一般比较稳定。（二）活化诱导的淋巴细胞凋亡检测【原理及意义】活化诱导的淋巴细胞凋亡（AIC D）是免疫调节的重要途径之一。体外研究淋巴细胞 的凋亡将有助于防治因淋巴细胞过度活化而导致的自身免疫性疾病和免疫损伤。已知 IL10、TGF0、IFNy均可体外诱导T或B淋巴细胞凋亡。本试验重点介绍研究淋巴细 胞凋亡常用的检测方法。（1

43、）活细胞悬液吖啶橙荧光染色法【材料】1 试剂：吖啶橙贮存液（10mg吖啶橙溶解于100mLPBS中，过滤,4C避光保存），0.01mol/L、Ph6.8PBS。2器材：吸管，试管，玻片，荧光显微镜。【方法】1制备待检活细胞悬液，浓度约为1x10mL。2 取95u L的细胞悬液， 口 5uL的吖啶橙贮存液混匀。3吸一滴混合液，点于洁净玻片上，直接用盖玻片封片。4 荧光显微镜观察或避光保存于4C，待观察。【结果】在荧光显微镜下，细胞核DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄色或 桔红色荧光。出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿 色碎片。细胞坏死时，细

44、胞质内黄绿色或桔黄色荧光均可减弱或消失。（2）琼脂糖凝胶电泳法【原理及意义】培养或单细胞悬液用细胞裂解液消化细胞按常规法提取DNA后，置于含漠化乙啶的1.5%琼 脂糖凝胶中进行电泳，细胞出现PCD时呈典型的“梯状”条带，而坏死时，呈模糊的弥散膜状 条带。【材料】1 试剂：缓冲液，细胞裂解液，Rnase （10mg/mL溶于TE缓冲液中），醋酸钠，乙醇，苯 酚和氯仿。2器材：电泳槽，电泳仪。【方法】1 约106细胞洗脱后，1000 r/min离心5min，去上清。2用4mL的PBS重悬洗后，同法离心去上清。3 置液氮中骤冷，5min （无条件可省略）。4力口0.51mL细胞裂解液重悬细胞，50C

45、，过夜，不时振摇。5加等体积酚和氯仿、异戊醇各抽提1次（充分混匀，5000 g，5min）。6 取上清加入1/10体积的3mol/LM酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，混匀。7 液氮10min，1000 g，5min离心沉淀DNA，70%乙醇洗1次后，真空抽干，溶入500uLTE 缓冲液中。8 加入25uL Rnase， 37C 水浴，30min。9 取所制备的样品1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察。【结果判断】细胞出现程序化细胞死亡时，在琼脂糖凝胶电泳带上呈现有一定间隔的梯状条带，而 细胞坏死时则呈模糊的片状条带（无间隔），阴性对照者仅在近电泳点样处出现基因组条 带。（3）流式细胞仪观察一PI染色法【

46、原理及意义】细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型峰的特征。此外，根据细胞光散射特点，应用碘化丙啶（PI）染色可使之与坏死相区别。在DNA直方图上，凋亡细胞出现亚二 倍体峰，表现为二倍体峰（G1细胞）的减少，在G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。 而坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍体细胞量多少不等。在光散射 图谱上，前向光散射与细胞大小有关，细胞凋亡时常表现为细胞皱缩，故前向光散射低于正 常。细胞坏死时，常表现为细胞肿胀，故前向光散射高于正常。侧向光散射与细胞内粒子性 质有关，由于细胞凋亡或坏死均有细胞内碎片增多，故侧向光散射均高于正常。总之，细胞 凋亡出现低于正常的前

47、向散射和较高的侧散射，坏死时则呈较高的前、侧散射光谱。【材料】1 试剂：碘化丙啶(PI)染色液，Rnase (1mg/mL)，70%冷乙醇，0.01mol/L、Ph7.2PBS。2 器材：试管，流式细胞仪。【方法】(a) 标本制备1 培养细胞(1) 收集悬浮细胞于离心管中。贴壁细胞视情用酶消化后制成单细胞悬液，悬浮细胞 合并。(2 ) 8001000 r/min离心，5min，共2次。(3)用400目筛网过滤2次。2 新鲜实体组织(1) 取材组织用PBS漂洗干净后，浸泡在含PBS的平皿或青霉素小瓶中。(2) 用眼科剪尽可能将组织剪碎。(3) 吸去上清液，组织块转入大瓶中加入1020mL组织消化

48、酶(含200飓/m L胶原酶)，37C，30min，并在磁力搅拌器上搅拌。(4) 在不锈钢网上轻轻研磨，使组织和细胞分离。(5) 滤液用200目筛网过滤2次。(b) 荧光染色：上述细胞制备后均应进行荧光染色。(1) 制备的单细胞悬液可用70%乙醇固定，4C保存。(2) 染色前用PBS进行离心沉淀去除固定液。(3) 加200uL RnaseA，37C水浴30min。(4) 再加入800uLP I染色液混匀，至4C避光30min。(5) 上机测试。记录激发波长488nm处红色荧光。【结果】细胞凋亡时，G1峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型。在光散射图谱上，前向光散射低于正 常，侧向光散射高于正常。细胞坏死时，细胞周期中的细胞均出现不同程度的减少，亚二倍 体细胞量多少不等。在光散射图谱上，前向光散射和侧向光散射均高于正常。【注意事项】悬浮细胞收集时要保证足够数量，否则影响结果准确性。