流式细胞仪数据分析

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1、工作条件：1.1 电源要求:220V (10%)、50HZ (10%)1.2环境温度:5-35C1.3在相应湿度10-80%的环镜下工作2. 设备用途： 细胞分析和分选功能2.1分析功能：细胞周期测定，DNA含量分析，RNA测量与分析细胞凋亡检测，蛋白质总量测定，2.1.4 生物活性的测定，细胞內钙离子流动试验，Ca2+浓度测定，细胞内pH值测量，细胞內Oxidative Burst代谢产物，细胞表面电荷检测。2.1.7 抗原特异性免疫细胞的检测、分选和细胞治疗技术2.1.8 检测细胞因子，可溶性荧光蛋白等*2.2 细胞分选 流式一体化分选功能，采用捕获管技术，分选速度 300 个细胞/秒，分

2、选纯度 98%3. 技术规格：3.1 主机系统流式细胞仪主机系统：含15mw 488nm氩离子蓝色激光器，635nm红色激光器，4个荧光探测器和2 个散射光探测器光路：双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析：488nm激光器激发的三色荧光,635nm激光器激 发第四色荧光.采用测向光路设计滤光片：488nm激光的荧光通道包括530/30nm、585/42nm、670nm LP； 635nm激光的荧光通道： 661nmLP*3.1.4 可选用荧光：FITC, PE, PerCP,PI, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy，APC, Rhodamine, Cyanine 等必须配

3、流式一体化分选系统光电倍增管:光谱检测范围300nm-1100nm 电压150V-990V荧光检测灵敏度:100MESF全峰宽变异系数:CV10， 000个细胞/秒检测颗粒大小: 0.1um(min)-50um(max)最少样本体积：1001流动室孔径： 430um X 180um自动抽吸系统: 换样时自动吸去管道内剩余样本，避免样本之间的相互干扰*3.1.14 脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分(面积)及脉冲宽度,用脉冲宽度和面积区分双 连体细胞(如假四倍体细胞)3.2 数据处理系统苹果 MAC Pro 工作站3.2.1 CPU: 双核，主频 2.8G3.2.2 内存： 2G3.

4、2.3 硬盘：容量 300G3.2.4 独立显卡3.2.5 光驱：DVD-ROM, CD-RW3.2.6 显示器： 19 英寸液晶显示器3.3 应用软件3.3.1 全自动仪器校正软件3.3.2 多功能流式应用软件3.3.3 DNA 分析软件4资料4.1 有仪器全套电路图及中文操作手册4.2有中华人民共和国医疗器械注册证工作条件：1.1 电源要求:220V (10%)、50HZ (10%)1.2环境温度:5-35C1.3在相应湿度10-80%的环镜下工作2. 设备用途： 细胞分析和分选功能2.1分析功能：细胞周期测定，DNA含量分析，RNA测量与分析细胞凋亡检测，蛋白质总量测定，2.1.4 生物

5、活性的测定，细胞內钙离子流动试验，Ca2+浓度测定，细胞内pH值测量，细胞內Oxidative Burst代谢产物，细胞表面电荷检测。2.1.7 抗原特异性免疫细胞的检测、分选和细胞治疗技术2.1.8 检测细胞因子，可溶性荧光蛋白等*2.2 细胞分选 流式一体化分选功能，采用捕获管技术，分选速度 300 个细胞/秒，分选纯度 98%3. 技术规格：3.1 主机系统流式细胞仪主机系统：含15mw 488nm氩离子蓝色激光器，635nm红色激光器，4个荧光探测器和2 个散射光探测器光路：双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析：488nm激光器激发的三色荧光,635nm激光器激 发第四色荧光.采用测

6、向光路设计滤光片：488nm激光的荧光通道包括530/30nm、585/42nm、670nm LP； 635nm激光的荧光通道： 661nmLP*3.1.4 可选用荧光：FITC, PE, PerCP,PI, PE-Cy5, PerCP-Cy5.5, PE-Cy，APC, Rhodamine, Cyanine 等必须配流式一体化分选系统光电倍增管:光谱检测范围300nm-1100nm 电压150V-990V荧光检测灵敏度:100MESF全峰宽变异系数:CV10， 000个细胞/秒检测颗粒大小: 0.1um(min)-50um(max)最少样本体积：loom3.1.12 流动室孔径： 430um

7、 X 180um自动抽吸系统：换样时自动吸去管道内剩余样本，避免样本之间的相互干扰*3.1.14 脉冲处理系统:能同时分析脉冲信号峰值、脉冲积分（面积）及脉冲宽度,用脉冲宽度和面积区分双 连体细胞（如假四倍体细胞）3.2 数据处理系统苹果 MAC Pro 工作站3.2.1 CPU： 双核，主频 2.8G3.2.2 内存： 2G3.2.3 硬盘：容量 300G3.2.4 独立显卡3.2.5 光驱： DVD-ROM, CD-RW3.2.6 显示器： 19 英寸液晶显示器3.3 应用软件3.3.1 全自动仪器校正软件3.3.2 多功能流式应用软件3.3.3 DNA 分析软件4资料4.1 有仪器全套电

8、路图及中文操作手册4.2 有中华人民共和国医疗器械注册证流式细胞仪数据分析5.1 数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分 析结果。4参数（FSC, SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计 收集到10000个细胞时，FCS数据文件为8OkB。数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC （FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该

9、通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。 处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号 的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1 （FL1）, Y轴显示通道2 （FL2）。3维图通过X, Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。R_1His；Qgrann口 5写只眉匸-!-口Mn - z miFL12-D plQ；3-D platCellQuBst3-D plot At ractorsFigure 5-1 Graphic representations of flow c

10、ytom&tri 匚习题：数据采集及显示1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 。2二维点图用于显示 。3在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 。5.2设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析 淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC, SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图r-Jc-Fikioosb so m ng 渝 zic尸 SC.-HrUORMOO：eir习题：设门1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错）5.3 细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list

11、-mode文件中显示数据，然后统计点图中的细胞分布情况。如 前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群 如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。LuS：iuijoo 氏IFigurehcRmoqe53 Dot plot, with a gate encompassing the lymphocyte populaiionFSC图5-3 选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群 百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。 单参数直方图可定

12、位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以 输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右 边界（见图5-4）。左图中Ml为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。NORMOttl口NORMOa 吕Gwwrad FntCD? FIXFigure 5-4- Histograms of subclass control (NOR MOO I) and CD3 FITC NORM 002 with histogram markers and M2OKSLS.- OS?C_8Q图5-4阴性对照峰Ml （NORM001）和CD3 FITC阳

13、性峰M2 （NORM002）图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中Ml （阴性）细胞619个,Hi列Dg罔悒St就isiiesID:81|A|G佥；G1TotJ Events: 6000FilQ： 14)02M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2： 2272/2891=78.59%。t 9672891100.00耶.18；176.9286.7862.M191J0X ia21砂10 323.752.2S51 W301189H7227278 5037,87224.10212.203271220 67220

14、3 at ed Events: 2SS1MFL1-HCD3 (Lo?)ftMktr L也RMpht憧 第Gated 寬 Totsl Mfe浙 G皂o陆別iSdhftn PonkChFigure 5-5 Histogram statistics图5-5 直方图统计结果二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于 设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞 左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE）,左下象限(LR)为X轴阳性细胞(CD3 FITC)，右上象限(UR)为双阳性细胞(CD19+/

15、CD3+)。10O I13Figure 5-6 Dot plots of subclass control (NORMOOI and CD3 FITC/CD19 PE (NORM002) with quadrant markersHORMOOII f17 1 lqw1 irCjarrma-1 FTTCCD3 FTC图5-6阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002)如图5-7所示, 淋巴细胞亚群双阳性细胞(CD19+/CD3+)的百分含量为：296/2839=10.43%。feudrantStsdtisticsFileiNORMDOSLaDaJtsE

16、Unit: Linear Veduiesg叭俺 心 酣 11A|Tubs: CD3/C& 19Acqusitian Date: 2-Sep-93Gale: 31Oateil Evemts: 2 的Total Ewnts: 600 0Quail Events % Gated SSTotad Klvtean X Geo Mean Yhtean YSeoMeanIJL1.45土側570.11细陌UA0.1S0.0S他上IX.13053W 57LLm9 .S3倔4.664舸3.873.57LR79.5717.65224 J1?12 2SZUIJ8Figure 5-7 Quad rant statist

17、ics图 5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形 状的绘图工具定义所选区域(如图5-8所示)；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。那 FfTCFigure 5-3 Dot plot of CD3 FITC/CD4 PE -/jith four regionsFtegiMFile: NOF1MOC3Swpk 曲 401|A|1ubi:CD3KDMcShibGI石钛讯丘爬玳筑2犯*ToteJE-n(3：tQ(M)X P aramel-er FL 1 -H

18、D2 Leu4 (Log)V Perameter: FL2-H CEM Leu LogR帕Im毎 G*J*d 矗 TpitlH(3处 初 皿朗 甲 tfM 2| j|Evamt id F 口 fU MC 片 vtr巨卜f.h HiimOfllH1LM- CintrolH rB aTir lxr HC II I MH I 回 丫卩丽计5SC-M 1024 5SC- 回Gta Nl同Rol li-ls NiimOOlWc lilt mb BpuI FBaLCh沖 D*r I CO 93回fchrAi-wEY 匚厂EieUCutr Q 二|511匚：緒仙”：fiiennlrLsfian iirafc

19、J Tapp 3 |ffiw (ircb*r) 7i出! & ? | 耳勺肚丘冷 | w Text StyloFat 阳 Zb 的hdstw 円 |Qg |刖门刃叫釦1豆| 皿HZ bn 11T帆GOLT 口&KkgMnd Urippcrledp res z昶伽ipop-up contrd在CellQuest Pro软件中，如果Inspector窗口开着 的话，选中任意直方图或散点图就会出现该图的属 性，其中包括有X、Y轴的参数、是否多色显示、 图的分析或采集属性等等。Histogram Plot. Dot PlotDensity PlotContour P|q1+ 3D Plot-Rnnot

20、sttonFur ma I Hislugrupri.霍F Overlay.Hislogram Tools.Change Dstd File. 湍D NehI Data File匍】PreLiicju% to File 3 File IncremenLuuLog Data Unlitg”在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其 中包括了关于该图所有选项。建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命 名为 FS、SS、FL1、FL2、FL3 和 FL4。AcquireAccb isition 咅 5mr却Pararmet

21、ti DescriptianCustom Keyorcs CountersEdit Reagent List,.Edit Panels.audn ticiuestDiseonnECt from c/tometer 哉 ESort Setup在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description，可出现关于文件存储和 参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集 参数进行命名，FL1为CD3FITC, FL2为CD4PE。C, 设门并建立门与图之间的关系RF - +L _ JLXH一 ！i_广+S在工具栏上有左侧几个按钮可分别矩形门、自由门、线

22、性门、圆形门和自动门。MDm.(KE本处重点介绍Snap-To门，它可根据细胞 群体的分布自动调整门的形状适应细胞 群体。R与G的关系R 是 Region 的首个字母， Region 一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和 圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域 进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：Gate实际了个代数式，简称G,其运算式默认如下:G1 = R1，或 G2=R2当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2。此时G1就成了一个算术结果了。G1=R1 AND R2G2=R1 NOT R2G3=R1 OR R2壬口liflT

23、P! HEMK =区1 匸E01R1 ftPD R2 gG2P1 OFP?酣F1 AhD MOT RS:!二 E 汗HQ凹CJT IT 匸区z恥占V二 ES8|勺刖！自T1 tommWirduwz urnETGilarrcw曲md口w Ar口uisicicn 1 Ai to CFeijir、MjliiHilita -edIe-t Color Liilia IHnitan1:11Region List 管理门，可以重命名或删除门 色的工具。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜建立门与图之间的关系日 01朋忧L3対卩1贰b na-ic Fl列P fl1 TyJin 片 v ir创一FhHi

24、imODlfeiIlm-CintroltH rB aTir lxr HC II I3SH I 回 f卉gjgCT IQ24 WEO 回| 。缶皿開tosi Rol li-ls NiimODl 乩皿llifc虫b BpuI. FHnLCh沖 D*r I CO 93gWirAi-w Evw-.-t_ pEieuwur Q 二緒仙两AoiHlrLsfian irafcJ Tar|fl 3 | Ifftjo? | fflw (ircb*r) 7i出! & ? | 耳勺肚丘冷 | - Text StyloF* 阳Iwb的冈stw 円 |S |g皿可函引18可亘|皿kNbriTpkl: 沁+百.片4訂营|

25、 eme,印I-|K Firimlrr .i 空壬白 巧打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。Region 5 谊洁 Gate SfetsQuadrant Stats选择任意直方图或散点图，在Stats下拉菜单下 会有更种统计参数选项。对应于不同的图出现不同的统计参数。N?w Fxprinn Edit Expre&ion如何编辑这些统计参数虚肝D屯4|F-im-Nih: H R*tdSitiii 民“？ 朋 iK P imsM!=FLlHHWW-!MSLDiSaIA LasR-ftiisB rwi 口 Hen CmM-iK+wri-G-PmifiiBKiMife

26、ie lahJERBhr ECttT P rw*i r. r L2 -H flkHrmsi! i,L*jLI1O.QD.QS35213 Je&ja血羽awD0I290IJI沁帳93921LLBEWLTSLW：-inIMIR-anCLIO4H：9?MjB122 19gfedLw.Sl,施仙智 E：恒弋 耳诜孑善gj忙战仃 工巻严兰、兰Y *応汽选择统计参数框，在Stats菜单下的Edit Statistic 会变得可用，点出后出现统计参数编辑对话框。他 DuilHI rMkainM-ri-hY Fhuhmt H: J 网LiDiAi.Iu.Laih-YiAjFi*n 口：xi0K*-i rL+v

27、vvd CH 血白应 f-BjhisiWwJKit fnvai rL1LiEgtrn EwEa 馬疊titl!Ht*der Info y FitielLIn 5f FHe N別叱0、Laq Daio. Uni.aP barvpt IDS inhi wn w.jy . zn-M iriJMmm 鼻FdCien NimeQU.9AVX3二匚jccrn KEVHurd 1/ ute0 丹 nelAcgu !-iiiDr Lhittfl TniAl FvPrtl-iWj Giuc： Even&3 H-nam fixerJ Smuuii.lrg htrdijDn!iNa mnws!* 卓 41:LriK

28、tfirL*Ya宙M -S!W ErtariKCVY rnwf .rL2-H ：EHSLwlZiLi|二 CjSEi-r KcYcud #2二匸wm KdvrdStsrtafla VMarictr Label 牙 iMzrk 計 twumlY 皇L、上nt匚聊槓 P l!cryn of Laied _ Ppic*nc nr Tnc.il Mean匚 we an Hsd5 Ma 亡 M&5K EWHS卑習驚仙adfr Columns C 1 Column TS 2 Colu mn jtdpik gPcnk Chnnhcli wTtiwanrD, 显示统计参数StatsHisi-ciyfam aL

29、s5. 仪器的操作当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4 便可调取所有控制框：Cytameterftetectors/AnipE Tli岸冲did 匚 Gfin nation 5CtU5 、x3C2躺筋4Fnatrumterit SettingsTimeC al ih rationDctccwi /Ampsi血m 情*耐111 raTfaf fljfiBi iiummpP1 PGC I -MPi& FL2-A卩斗 FLZ 265Fr iiiin rySw ndoirvVnl meP可厂H

30、 E匚Po rnriv环| ?印L、. FSC-H2500弟占Ossc-K叫?剧 FLl-HC FL1*Z5-S 10F6Ho岚却0FLHCfhCThrtshddQ RLd-WNmw匚 Fotir ColCH MJM ?： FLF 半6. 文件的保存及调用实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文 件：如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包(前提 是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性)，有两种方案打开以 往的数据：方法一：选择直方图或散点图，打开该图的属性框(Plot-Format),见下图：pop

31、-up controlKPsr-soeer 丫 Pirn*F5C-H lOEdrsc-lB 回幻AH1 C2d3BC-Nil UM#riO O liibpcdur d-m rfeip tatbt Pint foiixih mkj*1讪Fib %rE 阿 1回TtH DlicniPot TH MormOQI ct-.n-rtk 禺Lzvikkn tirfiFalg叵M IL用|Ski? &也简TI 3呻幢FkM0$rrwdWeiklL 回 二 Hi Ge*海姒在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。方法二:选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择Chang Data File,

32、 打开要分析的数据包。Hhtogiam Plot. Dot Plot. Density Pht. Contour Plot. 恥 Piel. .not a UmFoma-t HL log ram. KFOi/erfayI rirfitag ram Tools.Whainpf 口乱恫 Fil亡“耗DIH-ext DiiTa fifeK：Previous Dta File捉Fit lnctmenl .NxtFile共.Previous Sample File藏Ldld SarniJSe FiltS.Log Cflta Units .附：CellQuest Pro软件所有下接菜单hlCQgriLni

33、S-EE.K-0 3WK5Mafkei- Listftegicn ListLl!t直匚Edit Poiwg-onGtttQuadr3.nl 5t-atsEditNew ExpTCSicin LdLt EjcfjFEicinAcquireMVlniiQuvS-etup .Kvn 阳粘Asqiw3itlo-n & &和炖 guParameter Descri pLia nCustarn KeywordsCount enEdit ReagiEnt ListEdit Parish.QuanTlQjsTDi ecq nnatE frenn Cvtomfetar38 EiHidc P耳ImtHide Iritpeinjr XIHide B ixhwjer4 Show Pac?a BrealSnap t! GridGrid.LGC訶吐& untll-dBfi?5-CT： yntirlKedttKR扌FaUent !F.Klnc Namfli NuTrftrrWest Sample Fili?StPre-viou& Srirple File昨Load Sample 冋屯上一ten Data Ur*it5