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1、枯草芽抱杆菌产a淀粉酶发酵试验化学与生命科学学院摘要：以枯草芽抱杆菌（BacilusSubtilisBF7658）为实验菌株，通过种子扩大 培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的 酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。关键词：枯草芽抱杆菌，a-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括a-淀粉酶、卩-淀粉 酶、糖化酶和异淀粉酶。芽抱杆菌主要用来产生a-淀粉酶和异淀粉酶，其中a- 淀粉酶又称淀粉 1， 4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的 a-1， 4-糖苷键，将淀粉水 解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又
2、称 淀粉 a-1， 6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的 a-1， 6- 糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以 酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。实验材料和方法一、实验材料：（一）实验菌株：以枯草芽抱杆菌（BacilusSubtilisBF7658）（二）培养基：1、种子培养液葡萄糖 1%Tryptone（胰蛋白胨）：1%,Yeast Extract（酵母提取物）：0.5%,NaCl （氯化钠）：1%调 pH7.2若配置固体培养基，则再加入 1.5% 琼脂。2、产淀粉酶发酵培养液玉米粉 2 .0 %黄豆饼粉 1 .5%CaCl2
3、 0 .02 %MgSO4 0 .02%NaCl 0 .25%K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠 0 .2% 硫酸铵 0 .075%Na2HPO4 0 .2 %调节 pH 值 7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管二、实验 1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。2、种子斜面及种子液准备-A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养 基，37C, 24h作菌种（3支/组）。-B.将配好的种子培 养液按每瓶50mL分装于 250mL 三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。-C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培
4、养液中（每支斜面接两瓶），37C 120r/min振荡培养16h作种子 液。 （ 6 瓶/组）3、发酵培养-按15-20%的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵 培养基的250ml三角瓶中。37C培养48h。-在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。 40-48h酶活降低后结束实验。三、a淀粉酶活性测定（1）上清酶液：发酵液0.8ml 5000rpm/5min，吸取上清0.5ml备用。（2）吸取 0.1mL 标准糊精溶液，转入装有 0.3mL 标准碘液的瓷板空穴中， 以此作为比色的标准。（3）在比色管中加入2%可溶性淀粉液20mL，加磷酸缓冲液5mL,在60C 水浴中平衡约5min,加入
5、0.5mL上清酶液，立即计时，并充分混匀。（4）定时（15s）取出O.lmL反应液于预先盛有O.3ml比色标准碘液的比色 瓷板孔内，当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准孔色相同时，即为反 应终点，记录时间 t四、计算酶活计算淀粉酶活力酶活力（U/mL） =（60/tx20x2%xn）m0.5 式中 t 为反应时间（分）， n 为酶液稀释倍数，0.5是使用的酶液量（mL）, 20 是可溶性淀粉溶液体积 ml五、溶液配制碘原液：-1.1克碘化钾加少量水溶解，加入碘0.55克，溶解后定容至25ml, 贮于棕色瓶中；0.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）- 称取45.23g磷酸氢二钠（Na
6、2HPO412H2O）、8.07g柠檬酸，用水溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正其pH至6.0。比色用标准碘液：-取碘原液2ml，加碘化钾20g，蒸馏水定容至500ml贮于棕色瓶中； 2%可溶淀粉：-称取可溶淀粉2克加少量水调成糊状，在搅拌下缓缓加入约70mL 沸水中，然后用水分次冲洗残余淀粉后加入沸水，继续加热煮沸至 透明（约20min），冷却后加水定容至100ml。（当天配制）。标准糊精溶液-称取分析纯糊精0.06克加少量水调匀，倾入80-90ml沸水中，冷却后加水定容到 100ml结果a-淀粉酶产生的时间在上述培养条件下，12 小时之前蛋白酶活力较低，36 小时达到高峰 继续培
7、养至 60 小时，酶活逐渐下降，结果见表 1。表a-淀粉酶活力与培养时间的关系发酵时 长取样 瓶号pH加入酶与溶液的 量发酵上清酶活测量平均酶 活稀释倍 数反应时 间稀释倍 数反应时 间41-2-16.770.5mL 酶 2mL 淀 粉1无终点1无终点081-2-16.731无终点1无终点0121-2-16.431无终点1无终点0161-2-16.64132114011.32201-2-16.630.5mL 酶 2mL 淀 粉125813330.74241-2-16.730.5mL 酶 2mL 淀 粉14T214471.074281-2-16.78135814321.134321-2-16.7
8、4120212142.256361-2-16.77113311273.204401-2-16.5314911025.262441-2-16.58110811203.918481-2-16.570.5mL 酶 2mL 淀 粉1581579.244h酶 活1-1-16.530.5mL 酶 3mL 淀 粉134914571.3921-1-26.270.5mL 酶 4mL 淀 粉112511403.921-1-36.850.25mL 酶 2mL 淀 粉114412073.1481-2-16.57120712492.4821-2-27.05123012252.4411-2-36.78121112222.
9、6421-3-16.61141814301.3641-3-26.54123812152.4731-3-36.77123012442.298a -淀粉酶的活力随细胞的生长而增强,进入对数期后，酶活显著提高。培养至 36 小时，随着芽抱、晶体的脱落亦即随着菌体的自溶，酶活达 到高峰。参考文献1. 唐丽江，王振华，王迪.安徽农业科学，Journal of AnhuiAgri.Sci.2009,37(12):5362-5363,53712. 陶文沂, 桧山圭一郎, 浜田信威, 竹西繁行, 冈田茂孝. 枯草芽孢杆菌糖化 型a-淀粉酶的研究(I )糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化J.食品与 生物技术学报, 1984, (02)
枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验
