抑癌基因p53的突变与修护激活

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1、抑癌基因p53的突变与修护激活031134 刘潇钦摘 要：p53作为一种代表性的抑癌蛋白，是肿瘤分子生物学的研究热点。然而，野生型的p53通过不同位点的点突变会形成不同类型的突变型p53，突变型p53不仅丧失了野生型p53的抑癌功能，更获得了某些癌症症状起增进作用的新功能。本文着重简介野生p53的构造和功能，论述其突变的措施和类型，罗列突变p53的危害，以及重新激活修护p53的措施。核心词 p53；突变；激活修护野生型p53的简介人的p53基因位于第17号染色体短臂，分布于大概20Kb的DNA区域中。它由11个外显子和10个内含子构成。启动子中不具有CAAT、TATA、GC盒等常用启动序列，转

2、录产生2.5kbmRNA，翻译生成由393个氨基酸残基构成的，分子量为53kd的蛋白质。(1)p53 蛋白涉及3个功能调节区域(如图1): 图 1(1)N-端的活化：通过与转录因子TFD结合而发挥转录激活功能，序列上又可细分为转录活化域和富含脯氨酸的SH3域；(2) 序列中段DNA结合域：能与特定的DNA 序列结合, 调节靶基因的转录活性，p53 突变多发于此区域；(3）C端功能域：涉及核定位信号、出核信号、四聚化构造域及一种调控功能域, 参与p53 细胞内定位、四聚化以及对中央DNA 结合域的调控作用。(2)(3)正常状况下细胞内p53蛋白的含量很低,这重要是由MDM2介导的p53迅速降解来

3、调节的。当应激多种损伤信号时, p53蛋白被磷酸化修饰, 避免了在细胞质中发生的MDM2对p53的降解，从而使核内的p53水平迅速升高。激活的p53通过其DNA 结合区结合靶基因的启动子。并借助其转录激活区诱导其下游基因的转录体现。p53活化对细胞有两种潜在影响:一是使细胞停止在G1或G2期，导致损伤的细胞得以修复；二是诱发细胞凋亡，清除变异细胞。但p53的抑癌功能常因突变而消失，使细胞无限分裂增殖，导致癌症的发生。(3) (4)但肿瘤细胞中的p53或因突变而失活，或因与宿主或病毒的某种蛋白质的结合而失活。失活后的p53蛋白便丧失上述功能。P53的调控机制近年来，对p53抑癌机制研究日趋进一步

4、。在不同的癌症中，其调节网络各有特点。下面就一种典型的调节通路：MDM2的调控作简要简介。癌基因MDM2编码的蛋白质通过与p53 的17-22位氨基酸残基相结合，阻断p53的转录调控通路。MDM2还可与p53特异的泛素酶共同作用, 增进p53蛋白降解。MDM2- p53复合物广泛存在于s和G2/M期细胞中。p53激活MDM2的体现，而生成的MDM2蛋白克制p53活性，形成MDM2依赖的负反馈调节机制。研究发现，MDM2在肉瘤, 乳腺癌, 脑瘤, 膀胱癌, 肺癌和白血病中的体现量明显高于正常组织或细胞。乙酰化是调节p53蛋白活性十分重要的方式：1.乙酰化可封闭p53赖氨酸泛素结合位点，克制其降解

5、，增强p53稳定性。2.乙酰化有助于转录调节活性的短暂分离，对下游靶基因的活化起重要作用。3.乙酰化作用或许诱发p53C端构象变化，破坏C端的回折，提高p53与DNA的结合能力。4.乙酰化可协调p53在胞质与胞核间的分隔分布。磷酸化可增强p53与乙酰化酶的互相作用，增进p53 C端乙酰化，建立p53磷酸化-乙酰化级联反映，p53在细胞内汇集并向核内转位。修饰后的p53形成有生物学活性的四聚体，与靶基因的p53反映元件结合，控制着下游靶基因的体现，从而引起细胞生长阻滞、凋亡。研究发现MDM2的酸性构造域是克制p300 介导的p53乙酰化的必要因素，该构造域还介导p53去乙酰化作用，进而影响p53

6、的功能和活性。研究发现p14ARF 不仅可使MDM2失活,还可增进p53蛋白的稳定体现。检查点激酶1和检查点激酶2可诱导p53磷酸化，削弱MDM2与p53的结合，从而提高p53稳定性。(3)p53的突变类型TP53 突变在肿瘤发生中是非常常用的, 不同位点的点突变产生了多种形式的突变P53蛋白(1)。P53突变的类型涉及基因片段缺失、插入, 点突变引起的错义突变, 以及杂合性缺失。但是在所有p53 突变形式中, 占主导地位的还是因点突变引起的错义突变, 其比例约占总体的80%。而在这些p53错义突变中, 发生在DBD区的点突变比例高达97%。事实上，p53的DBD 区每一种氨基酸都可发生点突变

7、而形成相应的突变体,。但是如下6个位点的突变在癌症中高频率浮现，与癌症进程紧密关联，被称为热点突变。它们分别是: R175、G245、R248、R249、R273、R282(标注如图1)。p53的突变可以分为三类：1. DNA 结合缺陷突变体：是指那些负责与特定DNA序列结合的氨基酸残基发生点突变，致使p53与DNA结合能力削弱。例如R273H(小鼠中为R270H)。2. 构象突变体：是指那些发生点突变后变化了本来野生型p53的整体构象。例如R175H(小鼠中为R172H)。3. 以上突变都变化了p53 的三维构造, 而R273H 突变失去DNA结合能力是由于273位突变后的精氨酸残基支链过长

8、,空间效应克制了和DNA的结合。从功能上来说,突变型p53在丧失了抑癌基因功能后，还可以通过显性负效应克制野生型p53的活性。显性负效应是指一种等位基因上发生的突变损害了另一种等位基因的正常功能， 使其产生没有活性的蛋白。在癌症发生过程中， 一般是p53,的一种等位基因发生突变，另一种保持野生型p53活性。这时在细胞内同步存在突变型p53和野生型p53两种蛋白单体，突变型p53与野生型53 通过彼此C端四聚化构造域形成寡聚蛋白时，突变型p53克制野生型p53活性，占据主导地位。最后，在癌症的发展过程中，野生型53 等位基因丢失。(2)后果1. 突变型p53可以形成更稳定的四聚体：以往的研究证明

9、p53 在正常细胞内含量很低，野生型p53是通过修饰避免了水解从而得到激活。而突变p53是如何避免水解的呢？研究发现, MDM2作为p53最重要的负调控因子，它的转录体现处在p53的控制之下。突变p53不能有效激活MDM2体现，使p53失去了MDM2 的负调控, 从而导致了突变p53在肿瘤细胞的核内积累。这一发现提示突变p53形成的四聚体也许具有与野生型p53 不同的转录激活功能。(4)2. “功能缺失”与“功能获得”：功能缺失：一般来说，p53发生突变后, 会丧失野生型p53所具有的细胞周期阻滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维护基因组稳定、错配DNA 碱基修复等抑癌基因功能。功能获得：突变型

10、p53 获得了一系列类似癌基因特性的功能, 例如转录一系列靶基因加速癌症进程、增强癌细胞化学耐药性、制止癌细胞凋亡的发生、克制p63、p73活性等, 这一过程被称为突变型p53的“功能获得”。新近研究表白, 突变型p53 还克制了MRN-ATM 通路活性。(2)3. 变化转移能力：已有数据表白, p53+/、p53/小鼠高度肿瘤易感,具有在初期自发成瘤的表型。在其所生肿瘤中, 淋巴瘤和肉瘤占主体，但是在人类Li-Fraumeni 综合征中较常用的上皮组织来源的瘤却很少。而基因型为p53mutant/+、p53mutant/小鼠的肿瘤谱构造发生了较大变化, 上皮组织来源的瘤比例大幅提高，并伴有较

11、高的肿瘤转移率，能更好地模拟人类Li-Fraumeni 综合征。可见，mutp53 在肿瘤发生和转移中发挥了重要作用。(2)突变型p53获得癌基因特性的机制研究者们觉得至少存在着两种机制(图2): 1.突变型p53可以作为具有癌基因活性的转录因子, 调控下游一系列靶基因的体现, 加速肿瘤的发生发展。这其中又涉及两种状况, mutp53独立启动的转录和与其她蛋白因子协同启动的转录;2.突变型p53可以与p53家族的此外两个重要抑癌基因 p63、p73互相作用, 克制了p63、p73的活性。图 2肿瘤治疗新方略：肿瘤细胞内重新激活p53小分子和多肽再激活p53绝大多数的P53突变是错义突变, 这些

12、突变位点多发生在p53的DNA结合构造域, 导致突变的p53 不能与DNA 正常结合, 失去了转录激活能力,进而失去了肿瘤克制的能力。后来科学研究发现，引入小分子或多肽与突变p53结合可以恢复其与DNA的结合功能。1.引入多肽实验证明， 通过引入针对突变p53 R273H、R273C、R248Q、R282W 的C末端设计的多肽，通过其与突变蛋白的互相作用变化其构象能恢复突变p53对特定序列的DNA结合能力，进而产生生长克制或诱导凋亡。这一成果也许是由于该多肽稳定了p53的核心折叠构象, 加强了与DNA的结合能力。p53核心构造域(DNA 结合区)对p53发挥其抑癌作用起核心作用, 因此可以设想

13、如果能稳定野生型p53的核心构造域和校正突变p53的核心构造域就能使其发挥抑癌作用。这一方略的设想是找到一种配基, 能对的与突变p53核心构造域结合， 并且能通过与突变p53的结合变化突变p53的核心构造域，使它的折叠构象向对的方向转变。p53 蛋白的稳定还与细胞内的分子伴侣有关,研究发现p5 能与Hsp40、Hsp70和Hsp90结合。未折叠的突变p53与Hsp70有高亲和力，远超过野生型p53，这一发现提示我们，Hsp蛋白也许稳定了突变p53的未折叠构象，因此制止Hsp蛋白与突变p53的结合有也许使突变p53恢复折叠构象。(4)2.引入小分子相比多肽来说, 小分子治疗拥有更多优势，如不易引

14、起免疫排斥反映，使用以便, 可静脉注射或口服等, 因此寻找有效的小分子就显得尤为重要。(5)对作用于突变p53的小分子的寻找有两个重要途径：蛋白分子水平分析和细胞水平效应分析。前一种措施可以确认突变p53蛋白与小分子作用后的蛋白变化和理解相应的机制，但不能拟定该小分子与否能进入细胞及与否有细胞毒性等；而后一种措施可以观测到小分子作用后细胞的变化，与否能诱导细胞凋亡等，但却不容易解释具体的分子机制。通过以上两种措施， 目前找到了某些作用于突变p53的小分子化合物，如CP-31398、PRIMA-1、MIRA-1 等。CP-31398是在热变性条件下，从大量,小分子中筛选出的能保护p53核心构造域

15、的小分子，而PRIMA-1、MIRA-1 这两个小分子则是通过筛选能引起体现突变p53的肿瘤细胞凋亡的小分子发现的。在体外, 这些小分子能激活p53的正常功能,诱导p53目的基因如p21、MDM2和PUMA 等的体现，并且CP-31398、PRIMA-1 还能在小鼠体内克制肿瘤生长。重组的腺病毒在肿瘤细胞中体现野生p53通过重组涉及p53cDNA的腺病毒Advexin，在肿瘤细胞中体现野生p53进而激活p53途径，克制和清除肿瘤。选用Advexin载体是由于它可以转染多种细胞， 涉及分化和未分化的细胞，并且不会整合到宿主基因组上，同步它可以大批量生产，并且它的安全性已经得到证明。克制MDM2来

16、重新激活p531.p53-MDM2 复合物的空间晶体构造已经清晰，它们之间的疏水间隙被p53的3个氨基酸p53-Phe19, Leu26和Trp23占据，因此可以设想某些小分子模拟这3 个氨基酸和它们的方位来制止MDM2-p53的互相作用。通过高通量分析和计算机模拟，发现了某些MDM2-p53阻断分子，如Nutlins-3。在含野生p53并过度体现MDM2 的野生型和肿瘤衍生的细胞系中，低浓度的Nutlins-3就能有效激活p53途径，诱导细胞周期克制和细胞凋亡。2.以往的p53-MDM2克制小分子多是根据她们之间的3个氨基酸p53-Phe19、Leu26 和Trp23设计的，而MI-63的设

17、计还加入了第4个氨基酸Leu22,该氨基酸对p53-MDM2结合有重要作用。(6)MI-63高度亲和的结合MDM2上，克制p53-MDM2 互相结合。MI-63体现出比Nutlins-3更强的p53-MDM2克制能力，更强的促凋亡能力, 同步还发现MI-63与阿霉素有强协同作用。3.绝大多数的MDM2-p53 干扰小分子都是结合到MDM2上的来克制MDM2-p53互相作用的，可看作MDM2 的抗体。但RITA不同，RITA 结合到p53N端，增进p53的积累，同步在体内外克制p53与MDM-2的互相作用,因此RITA增进了p53 下游基因的体现并能有效诱导凋亡，RITA 的肿瘤克制能力是野生型

18、p53依赖的。(7)但这一解释遭到了质疑，最新的研究发现RITA 在某些含p53热点突变的肿瘤治疗中重新激活了p53 介导的细胞凋亡，也就是说RITA 并不是完全野生型依赖的。RITA 稳定p53的机制还在研究中, Krajewski 通过NMR数据证明RITA并不是直接作用于p53 而是通过其她机制稳定了p53。4参照文献1童坦君.P53的抑癌原理及应用前景J.生命的化学，1993,13(1):7-102李大虎, 张令强, 贺福初.突变p53研究进展J.遗传，.06,30(6):697-7033闫毓秀, 张淑萍，滑静.p53基因研究进展J.遗传，.04,24(2):74-774陆思千, 贾舒婷, 罗瑛. 突变p53功能研究新进展与个性化的肿瘤治疗新方略J.遗传，.06,33(6):539-5485胡巍,肖志强,陈主初,李建玲,张鹏飞,冯雪萍,易红,余艳辉,唐新科,刘清萍,梁宋平. 鼻咽癌细胞中p53互相作用蛋白质的分离和鉴定J.生物化学与生物物理进展，,31(7):628-6346钟叔平,淋巴细胞凋亡与p53蛋白体现关系的研究J.生物化学与生物物理进展，1999,26(2):150-1537罗贤文,杜芳静,吴烨,高楼军,李晓霞,基于金纳米粒子组装电化学DNA传感器检测p53抑癌基因的研究J.分析化学研究报告,.11,41(11):1664-1668