基因的染色体定位

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1、基因的染色体定位（一）关键词：基因定位荧光原位杂交放射杂交体在人类基因组计划（HGP） 中有二大部分内容，一是在2005年之前完成对人类基因组DNA约 3x109个核苷酸序列的测定，同时完成对基因的染色体定位工作；二是 开展基因功能的研究。基因定位与基因序列两者相辅相成，基因染色 体的定位既有助于基因序列的测定，又有利于对基因结构和功能的研 究，有利于进一步提示生物的遗传信息。基因测序技术，尤其是大规 模测序技术的建立，极大地提高了基因测序的速度。到1999年1月25 日为止，全世界已测出全部人类基因序列的7.3%，而部分生物，如酵 母、大肠杆菌等的序列已全部测定完毕，这样cDNA的染色体定位

2、工作 就显得尤为迫切。然而由于目前的基因大规模测序是建立在基因定位 的基础之上，而基因组的染色体定位（基因作图）工作跟不上基因测 序技术的发展，因而成了限制基因序列测定的主要因素。基因的染色 体定位方法多种多样，它可分为基因的遗传作图和物理作图，而物理 作图中最主要是荧光原位杂交（FISH）和放射杂交体（RH）二种。本 文就目前主要的几种基因作图方法作一介绍。1荧光原位杂交（FISH）原位杂交（ISH）原早被用于染色体组型和核酸分布的分析，后来，随 着技术的发展，它被用于基因染色体定位的研究，特别是非同位素标 记技术的发展，使得ISH的应用日前广泛。目前它已被用于肿瘤的细胞 遗传改变、人类的早

3、期发育、核与基因组的分子结构、不同种属间的 基因图谱比较、动物的细胞发生和无数的基因定位研究。用于基因染 色体定位的 FISH 已被称为 CO-FISH 或 COD-FISH(chromosomeorientationanddirectionFISH)1。CO-FISH技术是以生物素或地高辛等半抗原为标记物，采用随机引物法 或缺口平移法标记DNA探针，将探针变性后即可用于细胞分裂中期或 间期细胞核染色体的原位杂交并产生DNA-DNA杂交体，这种杂交体可 以被与半抗原有高度亲和力的荧光标记分子所检测到，而这种杂交信 号又可以被与荧光分子偶联的单抗所放大。此外，DNA探针也可以直 接标以荧光分子，

4、这些荧光分子有：FITC、德克萨斯红(texasred)及 最近开发的花青染料(cyaninedyes)等，如果这样，就不需要进行信 号检测和放大就可以直接观察DNA-DNA杂交体2。用于FISH的DNA 底物已经由原先固定的染色体和间期细胞核发展到伸展的单链DNA分 子、细胞核及染色体的自然形态等3。由于FISH技术已经可以在伸展 的DNA分子上进行，这样它的分辨率就达到12kb，并能在此区域内 作图。而传统的在细胞中期和间期进行的FISH只能分别分辨15Mb 和50kb左右的区域，分辨率的提高使得更详细的基因结构和基因内重 排研究成为可能；FISH对自然状态下细胞和染色体的研究可以阐明核

5、成分的分布并且不会出现象计算机三维重建分析时的干扰现象；同时， 还能对二条同源染色体转录活性的核功能进行研究，并可直接观察基 因表达过程中核成分的位置。FISH不仅能对固定的标本进行研究，还 能对新鲜的标本进行研究，更有报道认为它能分辨单一碱基的替换4。 用于基因定位的FISH技术经历了从用洗涤剂或碱裂解液处理细胞核产 生伸展状染色质，从机械拉展染色质到分子梳，再到最近的动态分子 梳技术（dynamicmoleularcombingDMC）5。DMC技术是分子梳技术和荧 光杂交技术的结合，它分为四个步骤：制备三氯硅烷包被的玻片； 从低熔点琼脂糖胶中制备DNA溶液;将玻片浸于溶液里5分钟， 使D

6、NA结合到玻片上；用300pm/s的速度将玻片从溶液中抽出。由 于在玻片-溶液界面处，浸在溶液中的部分对已抽出部分有一种持续的 回复力，加上它们的疏水性，硅烷的表面很快就干燥，使得被拉长的 DNA纤维不可逆地被固定于玻片表面，这种DNA纤维呈平等状、单方 向分布，似梳子状。整个表面的伸展是均一的Qkb/顷），它不受DNA 片段大小的影响。与其它方法相比，DMC技术有如下优点：在整个 平面的伸展可使杂交信号为单一信号，无需标化。不同的表面和不 同的溶液中DNA的伸展无变化。高密度的基因组DNA和杂交信号 可使统计分析在一张22x22mm的载玻片上即可进行。一定的DNA 断裂可产生持续的可分析数百

7、kb的DNA片段。可从同一种DNA溶 液中制备出许多伸展平面。2放射杂交体法（RH）尽管FISH技术可以对基因进行染色定位，但是从分子角度来看，它的 定位工作仍显得较粗糙，它只能将基因定位于百万个碱基的范围（2% 的染色体长度）。因此发展一种较敏感的技术势在必行。RH就是在这 样的情况下产生的，它的基础是Goss和Harris早期的工作，他们用大 剂量的X射线照射细胞，使染色体断裂；但是通过细胞融合啮齿动物 细胞DNA中并被其修复。在染色体上间隔越远的两个标记，越容易被 X射线所打断从而分离，出现在受体细胞的基因组DNA的不同位点。 大约通过对100个这种染色体被修复的融合细胞克隆DNA的标记

8、间断 裂频率和距离的分析，就可得出这些标记在其自身染色体上的位置6, 7。然而，RH法作图是建立在统计基础上，因此，由RH法确定的遗传图 谱并不一定真正代表标记物在染色体上的位置，所以建立一种特定顺 序相对性的测量方法显得十分必要。Cox等人对作了研究。他们不用二 倍体的细胞而采用只含单一染色体的单倍体细胞，得到了较好的效果。 由于RH法作图并不依赖于靶染色体上可供选择的标记物的有无，因此 在理论上它可以对细胞中单一拷贝的染色体进行分析；此外，RH另一 个特点是它的图谱精度可以由X线折照射剂量来控制，一般来说， 8000rad的剂量比较适中8。上述这种RH方法又称为照射融合基因转移技术 (ir

9、radiationandfusiongenetransfer,IFGT)这种方法比较繁锁，每条染色 体需要100200个杂交体细胞，这样人的整个基因组就需要4000个 杂交细胞体。Walter等人就此作了改进，他们不用啮齿动物细胞杂交 体，而是采用二倍体的成纤维细胞，并将改进后的方法称之为全基因 组照射融合基因转移放射杂交体法 (wholegenomeirradiationandfusiongenetransferradiationhybuids,WGRHs) 9。他们只需44个细胞克隆即可以对对整条染色体进行定们分析，而 且这种方法可以对大量的样本进行分析，大大减少了工作量和提高了 工作效率

10、。目前已有商品化的小鼠全基因放射杂交体板可供使用，这种板由 Goodfellow博士的实验室构建，他们是将照射后的小鼠129胚细胞与 TK-A23仓鼠细胞系融合10。3脉冲场凝胶电泳（PFGE）小的DNA分子（V3040kb）在琼脂糖凝胶电泳中的泳动速度与其大 小的对数成反比，而大的DNA分子其泳动速度却与其大小无关，只与 电泳材料的孔径有关。由此Schwartz等提出改变电泳或电场的方法可 达到分离大分子DNA的目的11。它需要提取大分子量的DNA，再用 稀有切割酶将DNA切成50kb以上的高分子量DNA。由于稀有切割酶 的识别位点多为6个碱基，而其中又往往含有CpG二核苷酸。因为CpG 二

11、核苷酸多以甲基化的形式存在于脊椎动物基因组中，易于脱氨和发 生6T转化突变；这种情况多在脊椎动物已知的看家基因5出现， 40%的基因有组织特异性表达；这样如果在基因组DNA中检测到一个 稀有切割酶识别位点，在很大程度上就可以认为是一个CpG岛和一个 基因的5端。此外，基因组DNA的甲基化是组织和发育阶段特异性且 经常甲基化不完全，这样用稀有切割酶切割就产生消化不全现象，不 同的甲基化类型具有不同的消化产物，在PFGE电泳上就可区分出个体 的不同组织、不同个体的同一组织、不同种类的个体和由体细胞杂交 制备的DNA等12。PFGE可以产生涵盖50kb到5Mb的基因组图谱，但它比较繁锁和工作 量较大

12、。稀有酶的缺乏和稀有切割分布的随机性使得PFGEF方法难以 排列数百kb以上的序列。4Contig 拼接(contigassembly)和染色体步移(chromosomewalking)正如象多态微卫星的出现使基因作图产生革命性变化一样，YACs之类 大基因片段(100kb )的成功分离，使得众多哺乳动物基因组物理标 签和长距离图谱的构建成为可能。目前构建YAC文库的载体多为标准 的pYAC4载体，它含有着丝粒和端粒以保证染色体在酵母细胞中呈稳 定的线性分子。极高分子量的基因组DNA就插入在选择载体的臂之间， 连接的人工染色体导入酵母的原生质体中复制并保持稳定。YACs中插 入片段的长度在50

13、0kb1Mb之间，它足以被用于物理作图。目前用 于YAC文库筛选的方法基于二种基本技术：是PCR技术13，是 杂交技术14。尽管杂交技术有其特点，但其信号低、重复元件产生的 高背景及技术要求高等缺点，使得它已渐渐被PCR方法所淘汰。尤其 是 IRS-PCR (interspersedrepetitivesequencePCR)的出现，更使 PCR 在 其中的优势得到充分体现15。一旦YAC的末端被分离，接下来的关键 是确定二个末端是否与预期的标签相匹配，由于被分离的YAC末端极 少适合于FISH，故只能用Southern杂交；如果这个末端测序后可作为 STS(sequencetagsite)的

14、话，也可以用PCR的方法进行鉴定。而最简单的 方法是通过contig标签与已知YAC比较来确定新YAC的位置；如果这个不行的话，可将末端与体细胞杂交体或放射杂交体板、基因组PFGE 图谱等一起分析16。由于YAC克隆存在的一些缺点，如嵌合和重组等，现在又发展了细菌 人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)、噬菌体 P1 克隆系统 和 P1 衍生的人工染色体(P1-derivedartificialchromosome,PACs)等，这 些质粒均是在细菌中进行繁殖，易于转导，可对插入末端进行直接测 序，有关这些系统的详细情况可从http:/bacpac.m

15、ed.buffalo.edu.中获 得。目前BACs和PACs已成为基因组计划的“序列准备模板(sequence-readytemplate)。利用文库构建整条染色体或基因组的物理 图谱主要采用二种方法：一是使用含有STS的图谱，根据有序的、重 叠的STS构建，它的首要前提是高密度、具有良好顺序的STS图谱；二 是通过建立大的标签进行指纹分析。利用PCR和杂交，再结合限制酶 消化，即可进行染色体步移。5 基因定位克隆(positionalcloning)基因定位克隆即是一种基因克隆的方法，同时又是一种基因定位方法。 一些与遗传病相关基因的克隆多采用这种方法，它先根据已知的遗传 标记进行连锁分析

16、和系谱分析，先确定候选基因所在的位置，再通过 其它方法获得基因的全部序列。基因的遗传连锁分析原理可参阅文献 17。大规模遗传连锁分析所需的计算机软件可以从下列网址中获得： http:/www.genome.wi.mit.edu/genome-software;突 变表型资源库在： 和 http:/www.genome.wi.mit.eduo基因定位克隆中获得基因序列的方法大致有18：对关键部位进行 直接测序，目前已经可以对500kb左右的区域进行直接测序；比较 基因组作图和测序，具体原理在下面讲述，有关的信息可从 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/XREFdb/ 中得到；

17、位置候选分析 (positionalcandidateanalysis)，从某种程度上讲，它将成为基因定位克 隆的标准步骤，它是在被克隆的基因(往往是ESTs形式)和它们相应 的 染 色 体 位 置 日 前 收 录 在:http:/www-shgc/stanford.edu/cgi-bin/smsg#GOTO;基因结构特征 分析，这方面主要有三种方法：HTF岛作图(非甲基化CpG二核苷酸)、 进化保守区分析和外显子捕获HTF作图法根据的是稀有切割酶对基因 组DNA的特征性切割，产生可识别的标记，如基因的5端和CpG二核 苷酸等，有人又称这为限制性标记基因组扫描 (restrictionland

18、markgenomescanning,RLGS)19;cDNA 捕获，它是根据 基因组DNA和已知cDNA序列同源，它们就能形成异二聚体。这样将 二者接上接头杂交后，再经过PCR扩增等即可得到未知基因。6 比较基因作图(comparativegenemapping)或 比较物理图谱 (comparativephysicalmaps)基因非编码区的进化明显比编码区快得多，通过对不同种已知基因的 比较可以发现，不同种属的基因编码区有相当高的同源性，因此可以 利用这个特性进行基因作图和基因定位。也就是说，一旦某一性状被 定位于动物染色体的一特定区域，这些信息(附近的ESTs和候选基因 等)也可以移植

19、到人的相应区域；同时，对一些不能在人体进行的致 死性状的研究可以在动物染色体上定位后，再映射到人类染色体的相 应位点。在这方面比较新的方法是L-yons等人的比较锚定标签序列(comparativeanchor-taggedsequence,CATS)20和 Marklund 等人的异种 二聚体分析(xenoduplexanalysis)21。CATS扩增不同脊椎动物的相同编 码序列，比较适合于对单一外显子的扩增，由于进行连锁分析的遗传 多态性在较短的编码区内比较难发现，且CATS扩增出来的序列长度一 致，限制了体细胞杂交体图谱的构建，要克服这些困难又要花费大量 的人力物力。异种二聚体分析是在

20、CATS基础上改进变而成，它是将不 同物种的PCR产物混在一起进行变性、复性，这样同源的二条链就可 杂交在一起，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出异种杂交体进行分析， 采用体细胞杂交体(SCH)作图法作图。7其它关于基因的染色体定位尚有不少其它的方法，不过这些方法几乎均与 上述介绍的方法相关，或者是与以下的一些方法结合，如：显微分割 法 (microdissection)、 荧光活化细胞分选方法(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)、变性寡核苷酸引物 PCR (degenerateoligonucleotideprimerPCR,DOP-PCR)、体细胞杂交体 (interspersedrepetitivesequencePCR,IRS-PCR)等 16，22。