膀胱肿瘤患者外周血源性树突状细胞表型及免疫功能变化

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1、膀胱肿瘤患者外周血源性树突状细胞表型及免疫功能变化刘 星，梁 平，周 波，张克勤，李彦锋，靳风烁 （400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科）摘要 目的 探讨膀胱肿瘤患者外周血源性树突状细胞（dendritic cells,DCs）的表型及免疫功能变化。方法 通过密度梯度离心法从膀胱肿瘤患者和正常人外周血分离单个核细胞，加rhGM-CSF和rhIL-4诱导培养树突状细胞，采用流式细胞仪检测2组DCs表达程序性死亡配体-1（PD-L1）、CD1a、HLA和CD83的变化，混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖能力和ELISA法检测分泌IL-10和IL-12的变化。结果 膀

2、胱肿瘤患者外周血DCs表达PD-L1（95.064.06）% vs （76.636.90）%和分泌IL-10（214.0013.75） pg/mL vs （83.787.95）pg/mL的水平显著高于正常组（P0.05），DCs表达CD83（16.201.91）% vs （35.531.58）%及刺激淋巴细胞增殖的能力均低于正常组水平（P0.05）。结论 膀胱肿瘤患者外周血源性树突状细胞高表达PD-L1、低表达CD83及过多分泌IL-10可能是膀胱肿瘤发生免疫逃逸的原因之一。关键词 膀胱肿瘤；树突状细胞；PD-L1中图法分类号：R737.14 文献标志码 A基金项目 国家自然基金(810720

3、89)通信作者 靳风烁，E-mail:jinfs5505The changing in phenotype and metergasis of dendritic cells in peripheral blood of patients with bladder carcinomaLiu Xing , Liang Ping , Zhou Bo , Zhang Keqin , Li Yanfeng, Jin Fengshuo （Department Of Urology, Da-ping Hospital & Research Institute of Field Surgery , Thir

4、d Military Medical University , Chongqing, 400042, China）Abstract: Objective: To investigate the phenotype and metergasis of dendritic cells (DCs) in peripheral blood of patients with bladder carcinoma. Methods: DCs were isolated from the peripheral blood of patients with bladder carcinoma and healt

5、hy subjects by density gradient centrifugation, respectively, and then the two groups of DCs were cultured in vitrol with rhGM-CSF and rhIL-4 inducing. The expression levels of PD-L1,CD1a, HLA and CD83 expressed on DCs were detected by flow cytometer, the proliferation of lymphoid cells stimulated b

6、y the two groups of DCs were tested by mixed lymphocyte reaction, and the levels of IL-10 and IL-12 secreted by the two groups of DCs were measured by ELISA assay. Result: we found that the levels of PD-L1 expressed on DCs (95.064.06%vs76.636.90%) and IL-10 secreted by DCs (214.0013.75 pg/mLvs83.787

7、.95pg/mL) were significantly higher in the patients than in the controls, whereas CD83 expression levels (16.201.91%vs35.531.58%) was significantly reduced（P0.05）. Moreover, the proliferation of lymphoid cells stimulated with DCs were decreased in patient group than in healthy subject group. Conclus

8、ions: the phenotype of DCs over-expressing PD-L1, over-secreting IL-10 and down-expressing CD83 may represent one of causes in the occurrence of bladder carcinoma immune escape.Key words bladder carcinoma; dendritic cells; PD-L1Supported by the General Program of National Natural Science Foundation

9、of China (81072089). Corresponding author: Jin Fengshuo, E-mail:jinfs5505 膀胱肿瘤是泌尿系常见恶性肿瘤，其术后高复发率已成为泌尿外科亟待解决的难题，免疫逃避是导致其复发的重要机制之一。树突状细胞是已知的体内抗原递呈能力最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell ,APC)，能有效激活相关特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，在肿瘤防治、免疫、器官移植等领域日益受到重视1。研究表明，树突状细胞（dendritic cells,DCs）的免疫功能变化与其表面受体的表达和分化阶段有关2。活化的T细胞在对

10、膀胱肿瘤细胞的免疫识别、抑制和杀伤中起着关键作用；共刺激分子提供的协同刺激信号作为双信号系统之一则是T细胞活化的前提3。Chen等4发现PD-L1作为B7家族的负性共刺激分子，能与程序性死亡分子（PD-1）结合成PD-L1/PD-1，负向调节T细胞受体(TCR)介导的信号转导和细胞因子的产生，导致T细胞功能的瘫痪。研究发现，PD-L1在肺癌、肝癌、胃癌、肾癌等多种肿瘤组织中过度表达，可能与肿瘤生物学行为密切相关5。本实验通过检测膀胱肿瘤患者外周血源性DCs表达PD-L1、CD1a、HLA、CD83及其免疫功能的变化，探讨其与膀胱肿瘤发生免疫逃逸的关系。1 材料与方法1.1 病例选择 我院201

11、1年11月至2012年9月，通过CT及病理检查确诊为膀胱高分级尿路上皮癌患者16例（肿瘤组），包括男性15例，女性1例，年龄4268岁，平均52.86岁，未接受过任何手术和抗肿瘤治疗。对照组为同期无任何免疫性疾病的健康体检者14例，包括男性10例，女性4例，年龄2848岁，平均34.28岁。受试者签署知情同意书，研究获医院伦理委员会的审批。1.2 主要试剂 RPMI1640、青霉素-链霉素(P-S)双抗(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，Ficoll人淋巴细胞分离液(天津TBD公司)，重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)、LPS粉剂

12、(Peprotech公司)，PE标记小鼠抗人PD-L1、CD83与HLA-DR、F1TC标记CD1a（Bioscience公司），IL-12和IL-10 ELISA检测试剂盒(北京四柏正公司)。1.3 DCs的体外培养和鉴定1.3.1 外周血源性DCs的体外培养 相同条件下肝素抗凝管采集正常人和膀胱肿瘤患者外周血20 mL，用密度梯度离心法分离获得贴壁生长的单个核细胞；加入1 mL含10% FBS的RPMI1640，添加rhGM-CSF、rhIL-4，使其终浓度分别为100、50 ng/mL；37 、5% CO2孵箱中培养；每隔60小时半量换液1次，换入含新鲜细胞因子的新鲜培养基，定期观察细胞

13、生长情况及形态变化。第7天收集DCs进行流式检测和混合淋巴细胞反应；收集上清-70 保存，留做EILSA检测。1.3.2 外周血源性DCs的形态鉴定 倒置相差显微镜下观察和拍摄不同培养阶段DCs形态。收集第7天DCs培养悬液，吸入到10 mL离心管，添加入8 mL PBS稀释、混匀；600 r/min，离心8 min，重复洗涤2次后弃上清，保留少量液体冲散、混匀沉淀细胞；滴加到用赖氨酸处理过的玻片上，静置沉降30 min；4%戊二醛固定30 min后，行清洗、再固定脱水、置换、干燥镀膜等；扫描电镜下观察、拍摄照片。1.3.3 树突状细胞表型分析 收集第7天肿瘤组及正常组DCs（2105个/管）

14、，加入荧光标记的鼠抗人PD-L1单克隆抗体、鼠抗人CD1a单克隆抗体、鼠抗人CD83单克隆抗体、鼠抗人HLA-DR单克隆抗体及相应同型对照，孵育30 min，PBS清洗2遍后，流式细胞仪检测。用Flow Jo软件分析数据。1.4 淋巴细胞增殖能力检测另收集外周血20 mL，分离获得T淋巴细胞，调整浓度为3106/mL（作为反应细胞）；收获各组第7天DCs用25 g/mL丝裂霉素去增殖，调整浓度3105/mL(作为刺激细胞)，以50 l/孔悬液加入96孔板中，每组设3个复孔；添加培养基使各孔终体积均为200 l，混匀后放入37 、5% CO2、饱和湿度的孵箱中培养96 h。每孔加入CCK8约20

15、 l，继续培养约3 h；上酶标仪检测（测定波长为450 nm）。增殖指数（proliferation indices）PI=肿瘤组D（450）值/空白组D（450）值。1.5 ELISA法检测DCs上清分泌IL-12和IL-10的情况 具体操作步骤按说明书进行，显色后15 min内用酶标仪检测D（450）值。最后样品D（450）值=测得D（450）值空白孔D（450）值，根据标准曲线求出最后的分泌值。1.6 统计学分析数据以表示，采用SPSS 13.00统计软件进行配对t检验分析变量间的差异性。2 结果2.1 膀胱肿瘤DCs的形态观察显微镜下观察：分散贴壁的单个核细胞诱导培养第2天后，细胞形态

16、变得不规则，少量细胞开始聚集成簇，半悬浮生长。培养第4天可见悬浮细胞团数量增多，细胞体积增大，呈棒槌状，细胞周边可见毛刺状突起。培养第7天，细胞团开始散开，细胞体呈圆球形，均有较长的毛刺状突起，为典型DCs（图1）。肿瘤组与正常组DCs比较形态无明显区别。ABA:未成熟DCs;B:成熟DCs图1 扫描电镜下观察DCs形态（4 000） 2.2 DCs表型分析 通过rhGM-CSF、rhIL-4在体外诱导膀胱癌患者和正常人外周血源性DCs，流式细胞仪检测发现：两者表达CD1a和HLA无明显差异（90.045.06）% vs （85.654.81）%，（73.633.05）% vs （68.315

17、.90）%，从表型上证明所培养细胞为DCs。肿瘤组DCs表达PD-L1显著高于正常组（95.064.06）% vs （76.636.90）%，差异有统计学意义(P0.05)，但CD83表达明显低于正常组（16.201.91）% vs （35.531.58）%，差异有统计学意义(P0.05)。说明肿瘤组DCs在成熟度上不如正常组，并且高表达负性共刺激因子PD-L1。2.3 混合淋巴细胞反应 成熟DCs有较强的刺激T淋巴细胞增殖的能力，MTT法检测两组DCs对T细胞增殖反应的结果提示：正常组PI值高于肿瘤组（2.140.70）vs (1.500.45），差异有统计学意义(P0.05)，说明正常人外

18、周血DCs与膀胱肿瘤患者外周血DCs相比有较强的刺激淋巴细胞增殖的能力。2.4 ELISA法检测IL-10和IL-12的分泌 肿瘤组DCs分泌IL-10量与正常组比较（214.0013.75） pg/mL vs (83.787.95) pg/mL，差异有统计学意义(P0.05)；2组分泌IL-12的量（44.795.51） pg/mL vs （37.173.72） pg/mL，差异无统计学意义（P=0.26）。说明膀胱肿瘤外周血源性DCs与正常人DCs相比，分泌负性细胞因子IL-10能力更强。3 讨论膀胱肿瘤是我国最常见的泌尿系恶性肿瘤，即使近年来荧光膀胱镜下膀胱肿瘤切除术率的提高，但其术后高

19、复发率的难题仍未得到有效控制，究其原因可能与免疫逃逸的发生相关。随着免疫治疗在肿瘤防治领域研究的深入，大多数学者将目光聚焦到了人体内抗原递呈能力最强的DCs上。聂志林等6研究发现膀胱肿瘤组织中浸润DCs数目的下降可能是膀胱肿瘤发生免疫逃逸的原因之一。本实验在相同条件下检测膀胱肿瘤患者及正常对照组外周血源性DCs表面特异性抗原表达及其免疫功能变化，进一步探讨DCs与膀胱肿瘤发生免疫逃逸的关系。研究表明，与DCs功能相关的表面抗原有CD1a、HLA、CD83、PD-L1等7。Prechtel等8研究发现CD83在DCs早期低表达甚至不表达，当DCs成熟时才表达，是DCs的成熟标志。在不同DCs分化

20、成熟阶段和受不同外界微环境细胞因子（如IL-10等）的影响下，DCs表面分化抗原表达和免疫功能也发生不同变化。本实验研究发现：肿瘤组中DCs表达CD83水平明显低于正常组，说明可能受膀胱肿瘤外周血微环境中某些因素的影响，肿瘤组DCs多处于未成熟状态；未成熟DCs的抗原递呈能力较弱，这可能是膀胱肿瘤患者DCs无法有效激活免疫反应，导致免疫逃逸的原因之一。 PD-L1是近年发现的负性共刺激分子，与受体PD-1结合后，可抑制T细胞增殖并促进DCs分泌IL-10，诱导特异性抗原T细胞凋亡，导致肿瘤细胞对机体的免疫逃逸12-13。淋巴细胞增殖反应是DCs激活淋巴细胞并发挥免疫功能的表现；DCs分泌不同的

21、细胞因子则可诱导TH0细胞向不同的方向（Th1/Th2）分化，决定后续免疫反应是向Th1型还是Th2型应答漂移，代表性分子主要有IL-12和IL-109。IL-12是诱导TH0向TH1分化的关键因子，能激发NK、LAK及T细胞的增殖、分化等，起到正向调节免疫反应的作用10。IL-10致Th2分化，是公认的免疫反应负调节因子，可抑制DC的产生和分化成熟，下调正性共刺激分子的表达，并可抑制TH1细胞的分化，而TH1细胞是诱导淋巴细胞分泌IFN-、IL-12、IL-2、TNF等肿瘤杀伤因子的主要功能细胞11。本实验提示：膀胱肿瘤患者血源性DCs高表达负性共刺激分子PD-L1，分泌高浓度IL-10，然

22、而刺激T淋巴细胞增殖能力减弱。因此推论肿瘤组DCs高表达PD-L1，导致DCs表面正负性共刺激分子失调，可能促进负性细胞因子IL-10的进一步分泌；在微环境中存在高浓度的IL-10可能是阻碍其DCs发育成熟，诱导免疫应答向Th2型分化，抑制DCs有效发挥其抗原递呈功能，刺激T淋巴细胞增殖的原因之一。Brown等14曾用PD-L1单抗阻断IL-10预处理DCs的PD-L1通路后，DCs的刺激淋巴增殖能力显著增强，从侧面也支持本实验的结论。膀胱肿瘤患者发生免疫逃逸的原因除了其自身的抗原性很弱，可以通过抗原调变等途径逃避免疫系统的监视外15，另一个重要原因就是肿瘤患者DCs免疫功能缺陷。此外，在部分

23、膀胱肿瘤患者中发现其复发肿瘤已不在原来位置，提示膀胱肿瘤的复发机制除了免疫逃逸外，可能与肿瘤多生发中心灶的形成有关；生发中心是在T细胞依赖性抗体应答过程中于外周组织内形成的特殊结构，滤泡树突细胞在生发中心反应的形成中也起着重要作用，但是机制尚未完全明确，所以可进一步着手血性转移复发患者的DCs功能变化及多生发中心灶的研究，多角度探索膀胱肿瘤的复发机制。综上所述，膀胱肿瘤患者外周血源性DCs高表达表面受体PD-L1，使其在微环境分泌过多的IL-10，可能是导致膀胱肿瘤患者DCs发育成熟缺陷，最终导致DCs免疫抗原递呈能力降低、发生免疫逃逸的原因之一。随着DCs体外诱导扩增技术、分子生物学和基因工

24、程技术在DCs疫苗构建方面的应用，构建能在患者体内建立肿瘤特异性、持久性的免疫反应的DCs疫苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式16-17。结合本实验结论，可考虑从膀胱肿瘤高表达负性共刺激分子PD-L1出发，通过封闭表面PD-L1抗原受体或siRNA干扰等技术阻断PD-L1在DCs的表达，为探索构建新型的预防膀胱肿瘤复发的DCs疫苗提供新的思路。参考文献：1 Schnurr M,Chen Q,shin A,et al.Tumor antigen processing and presentation depend critically on dendritic cell type and th

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