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1、单细胞RNA测序的样本制备指南在开展单细胞RNA测序之前，我们首先要妥善地制备 单细胞样本。这虽然有点困难，但本文介绍了一些诀窍和建 议，也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10x Genomics 的Chromium? Single Cell 3 Solution，不过也同样适用于其 他方案。 单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种强大的 工具，让研究人员能够揭开复杂的生物学系统，分析各个细 胞的基因表达动态，从而深入了解疾病发展过程中的细胞进 程。在此之前，分析混合细胞群体的基因表达一直是一项困 难的任务。当然，在开展单细胞RNA测序之前，我们首先要妥善地制 备单细胞样本。这虽然有点
2、困难，但本文介绍了一些诀窍和 建议，也许对您的实验有所帮助。这主要适用于10x Genomics 的 Chromium? Single Cell 3 Solution，不过也同 样适用于其他方案。了解您的样本样本制备的具体方案因样本类型而异，但无论 采用哪种方案，您都必须要确保上样的细胞是有活力的，并 且完全解离成单细胞。无论是细胞系还是组织，优化细胞解 离的操作都是必不可少的，这样才能避免细胞死亡和裂解。 死细胞会裂解，释放出RNA。这种游离RNA会增加背景噪 音，影响单细胞数据的质量。目前有不少现成的样本制备方案，但也许需要针对您的样本 类型来修改。比如，悬浮细胞系、磁珠富集的细胞和流式分
3、 选的细胞已经呈悬浮状态，只需要洗涤和计数即可。不过， 如果样本换成了组织，那就有必要精心优化解离操作，以确 保数据质量最高。另一个需要考虑的因素是不同类型的细胞在RNA含量上相 距甚远，而准确测定此参数将影响一些关键决定，比如文库 制备过程中的PCR循环数。举个例子，人外周血单核细胞 （PBMC）的RNA含量极低，只有0.75 pg/细胞，而HCC38 细胞系则富含RNA，含量达到21.6 pg/细胞。处理也要小心移液相信大家都对自己的移液技术充满信心， 不过，在处理解离的组织或悬浮的细胞时，还是要格外小心。 比如，当细胞静置在管中时，它们开始沉降，因此每次从管 的上部或下部吸取时，有可能吸
4、到不同数量的细胞。正确的 做法是每次移液之前先混合细胞悬液，然后从管的中部吸取。 同时，细胞必须被温柔对待。大家可能不知道，即使用宽口 径的移液吸头，移液混合也会对样本质量产生负面影响。下 图比较了在HEK293T细胞上开展的四种不同的细胞混合实 验对单细胞数据的影响。剧烈的移液混合和涡旋振荡都会导 致细胞过早溶解，释放出RNA，形成背景噪音，最终降低细 胞的reads比例。正确的做法是使用宽口径的吸头来轻柔混 合细胞悬液。洗涤在处理悬浮细胞、解离组织或大量细胞时，强烈建议彻底洗涤。这可以根据样本类型以及scRNA-seq方法来调整。建议的洗涤方案是用含有0.04% BSA的PBS 来沉淀和重
5、悬细胞两次，然后用最终体积的PBS和0.04% BSA来重悬细胞。过滤大的细胞团块或细胞碎片会增加微流体芯片的堵塞风 险。为了避免这种状况，建议在上样之前使用细胞滤网(cell strainer)，孔径大约为30-40 pm。不过需要注意的是，每次 过滤都会造成细胞悬液体积的损失以及细胞浓度的改变。因 此，如果需要过滤，在过滤之后应该对细胞重新计数。细胞计数和活力评估在洗涤和过滤之后，我们有必要测定细 胞活力，以便评估样本质量。尽管方法很多，但简单的台盼 蓝染色方法就不错，能够鉴定出活细胞和死细胞的比例。此 外，我们还需要开展细胞计数，准确了解样本中有多少个细 胞。血细胞计数器当然可以用，不过
6、还有更方便的计数工具， 如赛默飞的Countess II FL全自动细胞计数仪。影响细胞计数准确性的一个重要因素是细胞储液的浓度。研 究发现，细胞储液的浓度在700-1200个细胞/pl的范围内是 最理想的。超出这个最佳范围，可能导致细胞计数的结果不 可靠。如果样本不在这个范围内，建议相应地调整细胞储液 的浓度。去除死细胞样本中高比例的死细胞可能会影响目标细胞的 回收率。死细胞及其他污染物的去除对获得高质量的数据至 关重要。当然，样品中的死细胞比例可能差异明显，这要取 决于样本类型和制备方法。对于死细胞比例较高的样本，您 可以参考10x Genomics的技术指南(Removal of Dea
7、d Cells from Single Cell Suspensions Improves Performance for 10x Genomics? Single Cell Applications)。样本保存为了尽量避免转录组的变化，在洗涤和计数之后， 单细胞的悬液应保存在冰上，等待后续的文库构建。在理想 情况下，一旦样本制备好，应尽量在30分钟内使用。不过，样本在冰上具体能放多久，这也关乎到细胞类型。有 些细胞(如PBMC)如果长时间放在冰上，就会形成团块。 这些团块很难解离，增加了堵塞芯片的风险，而且每个团队 都被当成一个细胞，又降低了计数的精确性。在这种情况下， 我们应当尽量缩短放置的时间。结语在制备单细胞悬液时，提前规划和精心准备是必不可少 的，因为全面考虑各种因素，才有望获得高质量的数据。10x Genomics等公司提供了单细胞样本制备的许多指导，也提 供了特定细胞类型的示范方案。如果您的研究对象难以分离 到完整细胞，则可以选择新近开发的细胞核分离方案。
单细胞RNA测序的样本制备指南
