初学者 激光共聚焦应用技巧

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1、激光共聚焦应用技巧、巧用针孔（pinhole）1、针孔越大，光学切片越厚，图像荧光越亮，纵向（Z轴）分辨率下降。2、针孔越小，光学切片越薄，图像荧光亮度变低，纵向分辨率提高。（最终受限于物 镜）。3、贴壁细胞拍摄，荧光较弱，增大针孔（2-3AU）4、三维层扫，薄样品的精细三维结构获取，缩小针孔（0.8AU）。5、Live预览下的快速聚焦：增大针孔，快速找到焦面后在缩小。、自发荧光解决办法1、提高激光压低Offset2、进行光谱拆分扫描：标记前 样品-XY入扫描-标记后样品-XY入扫描Process:/Tools:/Dye separationAccrji sniQHSen Ransc Pnus

2、emei.PM I tBlacndH三、荧光弱时的对策:1、扩大PMT通道的检测范围2、增大针孔3、线/面叠加4、Live预览时降低激光强度，提高Gain； Capture时提高激光强度，降低Gain5、同时注意降低噪点：减低Speed， Frame/Line Average四、三维扫描的技巧1、补偿 CompensionMr of step4,4772-Volumsystem 6pEimi2fiQz-stfrp size2、对易淬灭的多标记样品，在顺序扫面过程中选择“between stacks”，先采集易淬灭 的荧光信号。trarnflstetwe41 h眼耳Sefunntiftl Sean-pD54bD9l3、 调节层切间隔距离(z-step size)ilBjMi I lslspa-