包涵体的纯化和复性总结

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1、包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解 充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M，离心把沉淀和上 清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的 办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶 解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白 弄丢了。此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶 剂

2、。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成分，如一些外膜蛋白、质粒DNA和其 它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA 和还原剂2-筑基苏糖醇（DTT）、B-筑基乙醇等反复多次进彳丁，因去垢剂洗涤能力随溶 液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至 少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/ 还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性

3、杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件 相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mMEDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、 脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质，这一步很重要,因为大肠杆菌 外膜蛋白Omp T（37 KDa）在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性，在包涵体的溶解和 复性过程中可导致重组蛋白质的降解。对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆 性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶 解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成

4、氤酸盐，对重组蛋白质的 氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不 会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广 泛采用。盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有 成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离 子交换色谱有干扰等缺点。包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯 合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包 涵体。8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现

5、沉淀，这种现 象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验三、关于包涵体的溶解：1、请教GST包涵体溶解2、包涵体的溶解十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换， 调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了3、有关包涵体的溶解问题强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包 涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素， 因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的 异氤酸盐能导致多肽链的自

6、由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、 正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶 解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一 些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如筑基乙醇、二硫基苏 糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶， 有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存？我在4度放了半个月，目前没出什么问题5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题？BI溶液在室

7、温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一 些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。做完裂解之后加Triton X-100轻摇3 0 min，蛋白溶解的会多些四、包涵体的复性1、包涵体如何复性包涵体的复性主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释2, 透析，超滤或电渗透析去除变性剂其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很 可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确 包涵体的复性还要注意以下几点：1. 首先要获得较高纯度的包涵体。2. 包涵体溶解要彻底，

8、一般应使溶解液体量较大，不 要怕蛋白被稀释，要有助溶措施3. 透析前后均要离心4. 透析不能太快.5. 纯化的最佳条件要摸索。小技巧：1 ）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100.2）包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性3 ）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还 加 入 一 定 的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h4）复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h5）复性率的测定 据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解）6）Tr

9、itionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培 养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就 很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。这段文字可以参考：用Novagen公司pET System Manual提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波 裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。渗透休克用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/mi

10、n离心0.5 min 去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600XV2/5, V1为渗透休克溶液1，V2为培养新 鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2 重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理： 上清用三氯乙酸（TCA Trichloroacetic acid）沉淀，加1/10体积100% TCA （w/v），涡漩 15 sec.，冰浴 10 min，13000 r/min 离心 5 min，100 ul 丙酮洗涤沉淀，干燥 1 h，加 V1/2 体积1x PBS

11、 (pH 10)溶解，-20C保存，取10 ul加入等体积2xSB,进行12% SDS-PAGE 电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s成像系统照相。超声波裂解细菌渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl (pH 7.5, 0C)重 悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min,然后13000 r/min离心5 min, -20 C保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用 Protein Extraction Reagent (Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster,提供)按 Nov

12、agen 公司pET System Manual提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌 100xOD600/3 ul体积加1% SDS溶解，加等体积2xSB，进行12% SDS-PAGE电泳分析， 进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。1.2.7重组融合蛋白的纯化PrP-pET-32a ( + )转化表达菌 E,coli BL21 (DE3)，TB 培养基中，25C，AMP 200 ug/ml， 摇床(250 r/min )培养至OD600约为1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至 终浓度 1 mM， AMP 200 ug/ml，

13、25 C， 4 h， 4000 g 离心收集菌体。 按Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。或使用笔者改进方法，将 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中 Buffer D 改成 Wash-Buffer， Buffer-E 改成 Elute-Buffer，最后用 Buffer-E 重生 Ni-NTA HiBind Rasin, Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后 12% SDS-PAGE凝

14、胶电泳分析。3、包涵体复性2精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度(可以试试4度诱导过夜)和IPTG的量， 降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成 GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变 性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了 1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶 效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成 正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的

15、复性条件也各不相同。5、包涵体复性问题包含体复性三大原则：1。低浓度2。平缓梯度3。低温有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。此外，透析的盐浓度(比如ura)要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。6、包涵体复性形成聚集物关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白 有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！7、复性中蛋白析出！出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化 的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透 析到正常。此外透析时必须

16、浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的 比率应该很低。若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；另外可将甘油浓度增加，范围可在30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。8、包涵体复性液配方对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于 盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都 没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；不过复性 过程主要是注意以下几个问题：1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；2）温度适宜选择4C；3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2

17、mg/mL；4）复性时间一般为24-36小时；5）低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、 以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；EDTA 可以防止蛋白降解；6）氧化还原体系，如 GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG 等.。还有就是你的蛋白质的特性9、什么叫复性成功复性效果的检测：根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率 进行检测。1，凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋 白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情

18、况。2, 光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状 态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。3，色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，4, 生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性 蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映 体内活性。5, 黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般 水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。6，免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比

19、较真 实的反映了蛋白质的折叠状态。在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有 的空间结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质 序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象 病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚 集的机制尚不清楚，许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的， 且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律：如聚集的发生是由链间的疏 水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用 这些知识建立了一些重

20、组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、 蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复 性方案将成为可能。另外，还向这位战友荐一文章，有关包涵体蛋白复性的文章！10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功问：最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性 条件下将包涵体溶解，经复性，透析后用GSH sepharose 4B纯化，结果得到了比较纯的 融合蛋白，这是否说明GST的活性已得到恢复（因为能与GSH结合），请问这种情况 下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？由于我的目的蛋白只是一个蛋白的 某一段，不具有酶活性，也不

21、是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接 用于制备多抗吗？溶液中的GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？是否需要透析除取 这些成分才能去免疫动物呢？答：1）。不可以。GST具体多大忘记了，但做为TAG使用的蛋白一般是很小的一段AA， 可以用相对应的抗体做PULL DOWN，亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的， 一小段TAG空间结构几乎没有，就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA对应 的抗体结合。2）。变性蛋白只是天然蛋白伸

22、直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然 蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变 性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理， 筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗 用来干什么。3）。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只 要没毒影响就不大，可以不用考虑。4）GST为26kd，你得到的蛋白活性应通过目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST 融合蛋白可以免疫动物，但抗体纯化须用GSH-sepharose 4B和蛋白A或G进一步纯化， 去掉抗G

23、ST抗体，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去GST，再免疫动 物,GSH,Tris是小分子，没影响。5）既然目的蛋白没有活性，何来得活性鉴定，复性是否成功，就主要是看是否恢复到 原来特有的三级结构，这就要看你目的蛋白的特异性，和天然的目的蛋白片断进行比较， 看其复性是否彻底，这必须有个对照，才能知道复性是否完全。不知道你得到目的蛋白 有什么用处，如果是用来做抗原，就没有必要进行活性鉴定了。变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除 去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶 液中的杂物质，但是Tris没有什么关系

24、，其就如同PBS 一样，本身是缓冲体系，不会 对免疫造成太大影响。6）做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过 他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些 另外，你看没看过菌液上清里的蛋白量？那里可能有许多的有活性的蛋白呀五、包涵体的纯化复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。（注：当然也可以 先纯化然后再复性一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行比如柱上复性。）六、综述以及其他1、蛋白复性和纯化在线资料1, 包涵体表达的蛋白的复性 2, 重组蛋白纯化方法组织细胞的破碎 目标蛋白的粗提 蛋白质沉淀方法 色

25、谱分离 2、综述蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。包涵体的组成与特性：一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与 水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无

26、法 形成正确的次级键等原因形成的。1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。 原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对， 过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量 明显与包涵体的形成呈正相关。3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使 中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可 溶蛋白的比

27、例。包涵体表达的有利因素：1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋 白的降解。2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有 利于分离纯化。4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。破菌：1、机械破碎2、超声破碎3、化学方法破碎分离：1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。2、过滤或萃取方法：洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗 涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿

28、素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中 洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。溶解：常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包 涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氤硫酸胍（GdnSCN）最 强。去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋 白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH9.0溶解牛生长激素和牛 凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方

29、法只适合于少部分蛋白 的增溶。变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环 境中不稳定，一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过 夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l 的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加 还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增 溶，有时

30、还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。复性：通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去 除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时 结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。复性中常采用的方法有：稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太 快，不易控制。透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人 称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进

31、行控制，缺点是不适合 样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，如华北制药的 G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。还原剂的去除：还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键 的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原 剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。常用的氧化方法有：空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点 是不易控制氧化还原电势。氧化还原电对（red

32、ox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化 还原电势，也可以在添加了还原剂如 BME、DTT的增溶液中直接加入 GSSG,如： 5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG（1.33/1）。复性的效率：复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白 质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松 的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的 方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率 在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓

33、度，变性剂的起始浓度和去除速度、 温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由 于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使 用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）： PDI可以使错配的二硫键打开并重新 组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的 转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，WPPI的作用是促进两种构象间的 转变，从而促进

34、复性的进行。3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子， 研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同 表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。4、0.4-0.6ML-Arg:成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5-30%。6、一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。7、辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时 候对蛋白质正确的折叠是有利的。8、色谱法：通过

35、将目标蛋白结合到层析柱上，减少蛋白分子间的相互影响，该方法得 到越来越多的应用，常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。当然，虽然有很多所谓的理性的复性方案设计，目前的复性工作更多的是一个经验的过 程，没有一种通用的方法可以套用。复性时的蛋白浓度：一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且 很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。复性效果的检测：根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率 进行检测。1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋 白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测

36、有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等，利用两种状 态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性 蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映 体内活性。5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般 水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别

37、是对结构决定簇的抗体检验，比较真 实的反映了蛋白质的折叠状态。几个复性的实例：1、MHCII JBC 269(47)： 1994增溶：16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度 1hr. 复性：8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.2、增溶：10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.复性：10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTr

38、is pH8.0 对起 始缓冲液密闭透析16hr，开口透析8hr，对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。增溶：7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.复性：稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEQ0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSQ0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%P

39、EGpH7.4 透析 3 次，温度 4 度。纯化：一般说来，复性液的体积较大，为了减少处理体积，在进行柱纯化以前可以先进行硫酸 铵沉淀，沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高，可以直接进行HIC纯化，目标峰经 适当稀释后(cond5mS/cm)进行IEX纯化，然后通过SEC脱盐，更换缓冲液，除菌 过滤后，在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。当然在复性浓度较高的情况下，也可以直接将复性液进行IEX纯化，优点是在纯化的同 时进行体积的浓缩，为以后的精制创造条件。从生产的角度看，由于每增加一步纯化工序便降低很多收率，所以可过两到三次柱纯化， 工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则，对

40、于纯度要求较高的产 品如重组人白蛋白，不得不进行多次纯化。包涵体的纯化和复性总结关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生 物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、 包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌?细胞的破碎方法.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震 荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶常选用 50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟， 此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时 间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，

41、超声完全了菌液应该 变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白 和核酸应慎用。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶 释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二 异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑 制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化 物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎 的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使 这些条件都要适合于目的物质的提取。这是标准配方：裂解液：50mM Tris-HCl（pH8.59.0）, 2mM EDTA,

42、100mM NaCl, 0.5%Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。（溶菌酶在这个pH范围内比较 好发挥作用）但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话，而且蛋白 的分子量又小于20kd的话，尽量减少溶菌酶的用量，会引入溶菌酶这 种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏 的标准是，溶液很粘.protocol是10ml-50ml缓冲液（菌体洗涤液，裂解液等）/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.但凡超声,我都用60ml裂解液，因为我们的超声仪（现代分子生物学 实验技术录象里的那种）很适合用100ml小烧杯，装60ml裂解液

43、，这样 能让超声头离液面不高不低，不会冒泡泡，也不会洒出来.菌多我就延 长超声时间.沉淀，也就是包涵体沉淀，如果要上柱纯化，一定要先用4M尿素洗涤 一下再用8M尿素溶解.如果不上柱，只是跑跑电泳，可以直接用8M尿 素溶解以后，离心取上清，加入适量体积的2、表达重组蛋白时，细菌 裂解方法都有哪些？在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在 裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。 我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒， 间隔5秒，重复99次。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌 体

44、来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌 液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我 用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶 是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌 液，仍然没有明显变化。真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条 件。溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，

45、如 果可以，应如何保存？加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被 释放出来。而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子 核酸打碎成小片段。我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀 跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带 以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是 部分破碎。不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用 超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能 比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是

46、否完 全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少 破碎条件优化的时间。我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了 一支，不过得后天到货，但愿它有用。如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？ 只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保 持PBS的pH8.0，同时溶菌酶的量一定要足！在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声 破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199 次。菌体来自500 ml培养物，用30 ml PBS重悬，超声效率还是 可以的

47、。哪儿的溶菌酶好用？我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重 悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系， 混匀，测pH降低到5-6，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到 84C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH 仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好 了。另一瓶200m培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5 秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次， 从外观来看没有太大区别。我简直要说tmdT。见鬼了。我的操作有什么地方不妥当，请各

48、位指正。溶菌酶的厂商要求是否很重要？我的诱导物来自1： 20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2 小时(0.8mM IPTG)。是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬， 我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用 30-40 ml重悬。但实际操作也不够理想。SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白 都要被超碎变性了。3、酵母的破碎酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞 壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我 归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：1机械的方法

49、：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。2化学裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状(希望高手点评)3尿素裂解液(尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0)高压匀浆。(这个好象也该在方法2中)4液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。5温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得;2O lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法

50、都可以和上面的几 种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至 液体状。此法的裂解效果不错的，不妨试一下。一篇文章是加尿素裂解液(尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0)，据说效果可以酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什 么影响。一般应该用这个方法。4、超声破碎的条件选择超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破

51、碎， 有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大 时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进 行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你 超声的量明显有关。5、如何鉴定细菌超声破碎的程度最简单的方法：涂片一革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟-显微镜观 察切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下6、细菌裂解的DNaseI不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细 看说明书，可能会有换算说明。另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能 有收获。我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华

52、美也有RNase free的DNA酶，定量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活 性单位定量的。我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做 一个预实验，选取符合你需要的酶量。其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切 温度（16度或37度）。7、超声裂解细菌是否完全？最简单的方法：涂片一革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟-显微镜观 察切记：只用结晶紫染色二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体 用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳， 然后用水稀释到4冲,离心把沉淀和上清分别跑电泳，

53、如此类推可以一 直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这 就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比， 因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和 沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间， 也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管 了。2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋 白、质粒DNA和其它杂质。洗涤常用1%以下的中

54、性去垢剂，如 Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇(DTT)、B-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离 子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取 的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度 的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的 大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使 用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如 Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除 杂质,这一步很重要，因为大肠杆菌外

55、膜蛋白Omp T(37 KDa)在 4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性，在包涵体的溶解和复性过程中 可导致重组蛋白质的降解。对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体 氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。 尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时 间较长或温度较高时会裂解形成氤酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共 价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后 除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法 纯化等优点，故目前已被广泛采用。盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶

56、解作用快而不造成重组蛋白质的共 价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可 能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和 层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常 是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜 后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来 发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4 度（呵呵，不好意思！）。不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析等 发现没有什么不良影响。所以，你不

57、用担心也许你的蛋白也只是和你 开了个玩笑呢！三、关于包涵体的溶解：1、请教GST包涵体溶解直接用8冲的脲或6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检 测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问 题的）我所用的包涵体提取方法：1. PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破 碎至清亮2.4度，lOOOOrpm离心10分钟，弃上清3 .用PBS或生理盐水洗涤沉淀2 3次4.往沉淀中加 19.7ml Buffer A 及 0.3ml2 0% 的SKL （十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静 置3 0分钟至2小时5.4度，1 0 0 0

58、0 rpm离心10分钟，取上清6. 口20%PEG4000 2 1 0 ul 至终浓度为0.2%，加5 0 mM的氧化型谷胱甘肽4 2 0ul至终浓度为1 mM,加100mM的还原型谷胱甘肽4 2 0 ul至终浓度为2mM，静置3 0分钟至2小时（亦可4度复性过夜）7以PBS（pH8.0）或TE（pH8.0）透析，取出一20度保存备用! Buffer A 配方：Tris-base 50mMEDTA 0.5mMNaCl 50mM 甘油 5%DTT 5mM2、包涵体的溶解十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相 代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同， pH

59、不同，前者钠盐便于保存罢了3、有关包涵体的溶解问题强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间 的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多 肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性 剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氤酸盐能 导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。 SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏 蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱 氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链 内的非活性二硫键。还需加入还原剂

60、，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）. 二硫赤薛糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些 包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的 杂蛋白影响了包涵体的溶解。4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存？我在4度放了半个月，目前没出什么问题5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题？BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在 碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。 具体有什么影响我也不是很清楚。6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合 蛋白是不能与beads相

61、结合的GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才 好结合，不知你的温和的去污剂是什么？做完裂解之后加Triton X-100轻摇3 0 min，蛋白溶解的会多些四、 包涵体的复性1、包涵体如何复性包涵体的复性主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释2, 透析，超滤或电渗透析去除变性剂其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个 以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具 体方法还要根据前期试验及筛选来确定！另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次 你家了多少蛋白呀？蛋白量过大也会使复性困难。你用的透析代是否

62、是新的，处理过没有？新代有化学杂质！最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够用了包涵体的复性还要注意以下几点：1. 首先要获得较高纯度的包涵体。2. 包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。3. 透析前后均要离心4. 透析不能太快.5. 纯化的最佳条件要摸索。小技巧：1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100.2）包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性3 ） 复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Argini

63、ne-Hydrochloride 12-24h4）复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h5）复性率的测定据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解）6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条 件比较难optimize o这段文字可以参考：用Novagen公司pET System Manual提供的方法，分别进行细菌 渗透休