实验一 相差显微镜的使用

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1、实验一 相差显微镜的使用一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。二、实验用品试剂：蒸馏水或生理盐水。器材：相差显微镜（相差物镜、转盘聚光器、调中合轴望远镜、绿色滤色镜、）载玻片、 盖玻片、牙签、滤纸条、指甲油。三、实验原理光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位（指在某一时间上光的波动所能达到的位置） 的不同。当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显 微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构 的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化（相应发 生的差异即相差），而这种微小的变化，人眼

2、是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观 察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差 变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观 察活细胞或未染色标本。相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变 光阑，用带相板的物镜（通常标有PH的标记）代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。 其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处，相板 装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射

3、光的相位以外，还 有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进行合轴调节的。相差显微镜在使用时， 聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环 状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的 光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。1. 相差同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是在某一时间上， 光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，我们 的眼睛很难分辨出这种差别的，只有变相差为振幅差（明暗之差），才能被分辨。当光波通 过两种折射率不同的

4、物质时，如由空气f水，或空气玻璃，其波长、振幅和相位均有不同变 化。如光波通过1cm厚的水和1cm厚的玻璃时，由于两者折射率不同，通过它们的光波在相 位上产生一定的差异。通过玻璃的光波相位落后，因为玻璃的密度和折射率比水大，所以光 波的波长和频率都小于水。相差决定于光波通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与 厚度的乘积之差（光程之差）。介质越厚或折射率越大光波减速也越大，即相差显微镜就是 利用被检物的光程之差进行镜检的。2. 折射与干扰 肉眼看不见的相差，只要利用衍射和干涉现象，把相差变成明暗的振幅差就可能看见。（ 1 ）衍射波在同一介质里传播是沿直线方向传播，如果在它传播的方向上，遇到迎

5、面档住的孔或 障碍物不比它的波长大很多，这次波就会明显地绕到障碍物后面或孔的外面去（传播路线发 生弯曲），这种现象叫着波的衍射。（2）干涉在同一种媒质里传播的两列波，如果频率与波长同，在两列波相交的区域里，由于叠加 的结果，每一点的合振幅都是一定的，并且出现振动加强或减弱，这就是波的干涉现象。光 通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光，衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中， 这两种光相遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，这就是光的干涉现象。如果物体 粒子是折射率稍大于周围媒质的极小的透明体时，由于光程（折射率与厚度的乘积）比较大， 所以通过粒子的光比周围的光在相位上有所推迟。这是因为

6、被检粒子的衍射光相位比折射光 相位大约迟1/4 波长的缘故。若是在直射光的通过点和大部分的衍射光的通过面放置吸收光 的物质或推迟相位的物质时，就能分别改变直射光和衍射光的相位和振幅。如果把直射光相 位推迟1/4波长，使与衍射光保持同一相位，合成波（P）等于直射光与衍射光的振幅之和（P=S+D）,振幅加大，亮度提高。相反地，把衍射光相位推迟1/4波长，两者的相差变为 1/2波长，合成波的振幅等于两波的振幅差（P=S-D）,这时亮度减弱变暗。光线的相位肉眼 是看不见的，但利用衍射和干涉的现象把相位差变为振幅差（明暗反差）就能用肉眼识别。 衍射光的相位比直射光推迟1/4波长，合成波由与两者干涉而生成

7、，形成被检物体的像，振 幅与 S 同，相位稍延迟。3. 相板的作用为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板。在圆形相的 平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分两部分：（1）共轭面：通常为环状，是直射光通过部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。（2）补偿面：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭面和补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质，当光线通过时，使 光波的相位或振幅改变，从而达到不同目的的观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改 变。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，使亮度改变。物镜的后 焦点位于透镜中

8、间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。 不同种类的相板对光吸收率不同，产生不同的反差效果，从反差上可分成两大类：（A）明反差或负反差：在相差显微镜的视场中，物象亮度大于背景亮度的现象。在被检物 体的折射率大于媒质时，被相板的共轭面（因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光的物质） 推迟1/4波长，同时吸收80%-90%,振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补 偿面的衍射光没有变化，由于直射光推迟 1/4 波长，两者（直射光与衍射光）有完全相同的 相位，合成波P等于直射光（S）与衍射光（D）之和（P=S+D）,故振幅加大。物象是这两 种波的合成波造成，即物象等于P,所以只有直

9、射光照射的背景亮得多。（B）暗反差或正反差：在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物象亮度的现象。与明反差 相反，把通过补偿面（涂有改变直射光相位的物质）的衍射光推迟1/4波长，使衍射光与直 射光的相位相差1/2波长，同时，直射光在共轭面（涂有吸光物质）被部分吸收。由于两者 在像点相互干涉的结果，使合成波振幅变小，被检物的影象比背景变暗。4. 光路与成像 相差显微镜的照明光束，由转盘聚焦器环状光阑的环状孔射入聚光镜，投射载物台上的 被检样品，经样品后，入射光除投射的直射光外，同时产生衍射光。衍射光的振幅较小，相 位滞后直射光和衍射光进入物镜，前者由环状的共轭面、后者由较大的补偿面透过相板，并 相互

10、干涉造像。样品的影象由直射光（S）和衍射光（D）经干涉后的合成波造成，背景仅 由直射光形成。由于直射光和衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果，或明反 差或暗反差不等视所用物镜的相板类型而定。四、装置1. 相差物镜 在相差物镜内的后焦面上装有不同的相板，造成视场中被检样品影象与背景不同的明暗反差。物镜在明暗反差上可区分为两大类：即明反差（B）或负反差（N）物镜和暗反差（D） 或正反差（P）物镜，标志在物镜外壳上，并兼有高（H）、中（M）、低（L）等不同反应。 有的相差显微镜用ph字样表示。相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜。2. 转盘聚光器 由聚光镜和环状光阑构成。环状光阑位于聚光

11、器之下，由不同大小的环状通光孔构成，环状光阑的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。转 盘前端朝向使用者一面有标示窗（孔），转盘上的不同部位有0、 1、 2、 3和4或0、 10、 20、 40和100字样。 0表示非相差的明视场的普通光阑；1或10、 2或20、 3或30、 4或100， 标示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。3合轴调中望远镜（CT） 又名合轴调中目镜，作为环状光阑的环孔（亮环）与相差物镜相板的共轭面环孔（暗环） 的调中合轴与调焦之用。使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差物镜必须匹配，且环状光阑 的环孔与相差物镜相板的共轭面环

12、孔在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠，以保证直射 光和衍射光各行其道，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。4.绿色滤色镜从色差的消除情况看，分为多束消色差物镜或PL物镜。消色差物镜的最佳清晰范围的 光谱区510-630nm。欲提高相差显微镜性能最好以波长范围小的单色照明，故在光路上加用 透射光线波长为 500-600nm 左右的绿色滤色镜，使照明光线中的红、蓝光被吸收，只透过 绿光，可提高物镜的分辨能力。五、操作1. 相差装置的安装 相差显微镜区别于普通显微镜的装置主要有相差物镜、转盘聚光器、合轴调中目镜和绿 色滤色镜四种部件。（1）相差物镜的安装 从物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜

13、，与普通目镜配套使用。（2）转盘聚光器的调换安装 旋转聚光器升降螺旋，把普通明视场聚光器至最低位，放松固紧螺丝，卸下普通显微镜使用的聚光器。把转盘聚光器安放到相应位置上，旋紧固紧螺丝，转动聚光器升降螺旋，使 升至最高位置。标示孔朝向操作者。将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面。 再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。2. 聚光器调中转盘聚光器调换安装后，要进行合轴调中，使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合一。 方法：(1)旋转集光器转盘的环状光阑，将“0”位对准标示孔，使普通聚光器的明视场照 明用的普通可变光阑进入光路。(2)旋转聚光器升降螺旋，升至最高位。(3) 打开光源，使视场明

14、亮。(4) 把被检样品放到载物台上，用低倍(4x)物镜聚焦。( 5)缩小镜座上的视场光阑开口，至最小。( 6)从目镜观察，在视场中可见一缩小的、明亮的、多角形的视场光阑图象。( 7)转动转盘聚光器的两个调中杆，推动聚光器，把视场中的明亮的多角形的视场光 阑图象，调至视场中央。( 8)开放视场光阑至视场同大，两者周边完全重合。否则，重新调中。3. 相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中拔出目镜，插入合轴望远镜，一边从望远镜内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动 望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将望远镜 固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一

15、致，然后左右前后调节环状 光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使 亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可 能是载玻片过厚之故，应更换。合轴调整完毕，抽出望远镜，换回目镜，按常规要领进行观 察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合轴调整。使 用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。在视场中看见环状光阑为一 明亮的圆环，而相板的圆环为一暗环，使用时两者要合轴，互相重叠。方法：(1) 相差物镜与环状光阑的匹配。如40x相差物镜的环状光阑转向ph3或40,使相应的 环状光阑

16、进入光路。(2) 把 CT 放入目镜筒。观察视场中明环与暗环图象。(3) 聚焦。转动CT目镜可调部分至清晰地看见明暗环。(4) 与暗环的调中重叠。相板的暗环是固定不动的，处于光路之中，暗环的中心。环状 光阑的亮环可调节。4. 相差物镜的选择20xPH=20倍，正反差，反差程度高40xPM=40倍，正反差，反差程度中等100xPL=100倍，正反差，反差程度低40xNH=40 倍，负反差，反差程度高40xNM=40 倍，负反差，反差程度中等100xNL=100 倍，负反差，反差程度低100xDH=100倍，暗反差，反差程度高40xDM=40倍，暗反差，反差程度中等20xDL=20倍，暗反差，反差

17、程度低10xBH=10倍，明反差，反差程度高20xBM=20倍，明反差，反差程度中等40xBL=20倍，明反差，反差程度低 相差物镜应用范围标示反差应用P正观察细胞或细胞内部结构N负观察微小物体如孢子、鞭毛和活的样品H高样品本身反差低的L低样品本身反差高的M中样品本身反差中等的六、实验步骤1. 取一张洁净的载玻片，滴一滴生理盐水或蒸馏水，用牙签刮自己的口腔粘膜少许与水混匀 盖上盖玻片。2.10x相差物镜旋入光路。3. 将相应于10x相差物镜的聚光器环状光阑移入光路中，完全打开聚光器孔径光阑。4. 将样品置于载物台上，聚焦样品。5. 调节聚光器。6. 观察物镜后焦面，调节环状光阑的像和相板中圆环

18、互相吻合。具体方法：取下一个目镜 插入聚焦望远镜，转动望远镜的接目镜，直到在望远镜中观察到清晰的环状光阑和相板的像7. 如果换用高倍相差物镜观察，需要移入相应的高倍聚光器环状光阑，重复以上调节步骤七、结果与讨论在相差显微镜下观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及胞质中存在的 颗粒状结构。八、作业与思考题1. 概述环状光阑的亮环与相板的暗环、合轴、调焦法。2. 用明反差与暗反差物镜分别观察同一物体，阐述其物象的区别。3. 相差显微镜有哪些特有部件，构造如何。4. 明反差与暗反差相板的构成及其原理。5. 相差显微镜的光路图。6. 相差显微镜为什么要用绿色滤色镜。7. 为什么相差显微镜可以直接观察活体样品。