实验10、大肠杆菌感受态的制备

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1、实验十、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.20.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞， 600细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状 态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。【器材与试剂】1实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高 压灭菌锅，微孔滤器（含0.22ym滤膜），酒精灯2. 实验试剂氯化钠，无水CaCl2，蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青

2、霉素钠， 琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后， 用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL, 121C高压灭菌20 min；LB固体培养基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0,蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121C高压灭菌20min， 分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60C左右时，加入1 mL氨苄青霉 素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯

3、化钙11.1 g， 用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121C高压灭菌20 min，4C保存；氨苄青霉素钠溶液： 准确称取氨苄青霉素钠0.5 g,用蒸馏水溶解并定容至5 mL,用微孔滤器过滤除菌后，分装 于Eppendorf管中，-20 C保存。3. 实验材料E.colDH5a, pUC18质粒【实验步骤】1 接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37C振荡（约250r/min）培养过夜。2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37C继续 振荡培养至OD600约为0.20.4 （约2 h）。3. 取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf管中，冰浴放置1030 min, 4C, 1500Xg离心 5 min,弃上清。4. 沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min, 4C, 1 500Xg离心5 min, 弃上清。5. 沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。 注意事项1. 应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。6002. 整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。3. 每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。【实验结果】