细胞实验的基本操作

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1、细胞实验的基本操作【细胞培养】 一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则迅速融化：必须将冻存在196液氮中的细胞迅速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞导致损害。具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。1.2、用75酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。1.3、在超净工作台中按顺序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2.2、从液氮罐中取出

2、细胞盒，取出所需的细胞，同步核对管外的编号。2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。3、平衡离心 将细胞悬液吸到离心管中，10001500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液 吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数 细胞浓度以5105/ml为宜。6、培养细胞 将复合细胞计数规定的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37和5CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞状况而定。一般，除少数特别注明对DMSO 敏

3、感的细胞外， 绝大部分细胞株（涉及悬浮性细胞）， 在解冻之后， 可直接放入具有10-15ml（510倍）新鲜培养基的培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以清除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐渐积累（可见到培养液变黄），并且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。1、贴壁细胞的传代具体操作如下：1.1、传代前准备：1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。1.1.2、用7

4、5酒精擦拭双手和通过紫外线照射的超净工作台1.1.3、对的摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作并且可减少污染。1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。1.1.7、从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观测细胞，并做好记录。1.1.8、细胞培养瓶经用75酒精擦拭后，再放入超净台。1.2、胰蛋白酶消化：1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，接近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗23次，沿壁（无细胞的一面）缓缓

5、加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。注意消化液的量以盖住细胞最佳，最佳消化温度是37。 1.2.2、显微镜下观测细胞：倒置显微镜下观测消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表白此时细胞消化适度。1.3、吹打分散细胞：1.3.1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽量不要浮现泡沫，否则对细胞有损伤1.4、分装稀释细胞1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。1.4.2、倒置显微镜下观测细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5105/m

6、l。最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。1.5、继续培养：1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶，合适旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25时为一种，占50为，占75时为。2、悬浮细胞的传代悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。 当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，10001500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。三、细胞的冻存细胞冻存的原则

7、是要逐渐缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞导致伤害。 1、具体操作如下：1.1、从增值期到形成致密单层此前的细胞都可以用于冻存，但最佳选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最佳换一次培养液。1.2、贴壁细胞经消化、离心（10001500rpm，5min）收集，悬浮细胞经离心收集；1.3、大概106个细胞加入1ml冻存液（10DMSO+90%血清），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；1.4、加入到冻存管中，每个冻存管加11.5ml的细胞悬液；密封；1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，管置于4半小时，然后置于-20两小

8、时，再置于-70两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；1.7、记下冻存管寄存的位置，作好冻存记录（冻存的细胞名称、代数、冻存日期等）。2、注意事项：2.1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它自身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子构造，以至于减少冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最佳戴上手套操作。2.2、不适宜将冻存细胞放置在0-60这一温度范畴内过久，低温损伤重要发生在这一温度区内，是“危险温区”。2.3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。2.4、细胞在液氮中贮存的时间理论上是无限的。但为妥善起见，特别是诸多未被冻存过的细胞在初次冻存后要在短

9、期内复苏一次，观测细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最佳也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。四、细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作如下：1、准备工作：取一瓶传代的细胞，按上述二的传代措施繁殖细胞，待长成单层后以使用。2、细胞悬液制备：细胞悬液的制备措施：用0.25的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测单细胞悬液。3、细胞计数：2.1、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.2、制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细

10、胞悬液（如5滴）到一离心管中，加入等体积台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可省略台盼蓝染色环节。2.3、将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边沿缓缓滴入，要保证盖片下布满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。2.4、记录四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观测，并移动计数板，当看到镜中浮现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格具有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。2.5、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

11、（细胞悬液的细胞数）/ml （四个大格子细胞数/4) 2104阐明：公式中除以4由于计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2由于细胞悬液于染液是1：1稀释。公式中乘以104由于计数板中每一种大格的体积为：1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）0.1mm3 ；而1ml1000mm3细胞计数要点：进行细胞计数时，规定悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；规定细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数精确性。取样计数前，应充足混匀细胞悬液，特别时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数精确；数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞汇集成团时，只按照

12、一种细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。注：4台盼蓝母液的配制：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4保存。使用时，用PBS稀释至0.4。五、细胞活力的测定1.染料排斥实验： 其原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞则能制止该染料进入细胞内。借此可鉴别死细胞和活细胞。常用的染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。以台盼蓝染色为例。环节同上述细胞计数的操作环节。注意如下几点:计数：在310min内，用血球计数板分别计

13、数活细胞和死细胞（死细胞被染成淡蓝色，活细胞则拒染）。台盼蓝染色时，时间不适宜太长，否则活细胞也会着色，从而干扰计数。活细胞率（）活细胞总数/(活细胞总数死细胞总数)1002、MTT比色实验：可测定测药物或病毒的IC50原理：活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化四甲基偶氮唑盐(MTT)，还原成紫色不溶性结晶物，沉积于细胞中。用酸性异丙醇或DMSO溶解后，于酶标仪上测定光吸取值。紫色不溶性结晶物形成的多少与活细胞数目和功能状态有关。2.1、将细胞接种于96孔板上，密度为大概105个/ml，每孔接种100l；2.2、培养至对数生长期加入待测样品；2.3、作用一定的时间之后，加入三蒸水配制的5g/ml的MT

14、T溶液，每孔20l；2.4、37温育4小时；2.5、取出培养板，小心吸去上清，注意不要吸掉底部的蓝紫色沉淀；如果是悬浮细胞则用板离心机离心后除去上清；2.6、每孔加入100l的DMSO，摇床上摇动30分钟以使沉淀溶解；2.7、用酶联免疫检测仪（DNA Expert）在595nm（或490nm）波长处检测96孔平板中每孔细胞的光密度值（OD值），按下列公式计算药物或病毒对细胞生长的克制率： 细胞存活率（）治疗组OD值/ 对照组OD值1002.8、求出各药物（或病毒）浓度下的OD值占对照OD值的比例，用此比例对药物（或病毒）浓度作图；在所得的曲线上，比例值为50时所相应的浓度就是IC50值。或根据

15、各浓度下细胞的存活率，采用Logit法计算IC50。六、细胞的运送装运细胞的措施有两种：1、冷冻贮存运送即运用特殊内内盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运送，多需空运。2、充液法2.1、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，布满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保存微量空气。若空气留量过多，运送时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。2.2、妥善包装、运送。一般在四五天内达到目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。2.3、达到目的地后，倒出大部分培养液，保存维持细胞生长所需的液量，置37培养, 次日传代。注：从其她研究室所取细胞时，应注意理解细胞的性状

16、、培养液、培养时的注意事项等 【 细胞转染】一、脂质体转染（Lipofetmiane ）1、转染前细胞的解决（以24孔板培养为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在24孔板内铺上0.5105细胞，500ul无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到8090的汇合率。悬浮细胞:在制备混合物前，将48105细胞用无抗生素培养基培养铺铺于24孔板内。2、转染措施（以质粒DNA转染为例）2.1、将DNA质粒溶于50ul无血清的OptiMEM Reduced Serum Medium中。混合均匀。2.2、将适量Lipofectamine 溶于50ul无血清的OptiMEM 中，混合均匀。在室温下孵育5分钟（在

17、25分钟内进行环节c）。2.3、孵育5分钟后，将上述两种混合物混合（总体积100ul）。轻轻混合均匀在室温下孵育25分钟（也许浮现雾状沉淀）。复合无在室温下六小时内稳定。2.4、在24孔板中每孔加入100ul的复合物以及适量培养基。十字法混合均匀。2.5、细胞在37。C CO2培养箱中培养1848个小时后，测量转染效率。在加完复合物46小时候可更换培养基。3、转染注意事项3.1、转染严格来说，每种细胞的条件是不同样的，如果实验时，不能拟定最佳转染条件，请在细胞实验组共享文献夹查找类似细胞的转染措施；3.2、转染成果的好坏，与DNA质量密切有关，务必在实验之前对去内毒素质粒DNA的质量进行严格鉴

18、定，至少采用如下两种措施：琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测，如果有条件，可对质粒DNA去内毒素质量的进行检测。 细胞有关实验操作措施【小量细胞样品TotalRNA的提取措施】一、实验环节（以细胞为例）1.1、细胞样品（1.0107个）去上清之后，加入1ml TRIzol溶液反复吹打至溶液清亮，转移入1.5ml Tube中室温下放置10min，如不能立即提取则放于-80保存（可保存一种月），提取时取出放于室温融化；也可按照正常冻存措施保存1107个细胞，提取时37迅速融化，5000rpm离心3min清除上清液后迅速加入1ml TRIzol溶液反复吹打至溶液清亮，室温下放置10min；1.2、加入

19、200ul氯仿（1/5TRIzol体积），先用枪混匀10-15下，再充足颠倒混匀2min，使两相充足混合，室温静置3min；1.3、4、10000g（1rpm）离心15min；1.4、小心吸取上清（中间有厚厚的蛋白层）至一新的1.5ml Tube中（可取干净），加入0.5ml异丙醇（1/2 TRIzol体积）先用枪混匀10-15下，再充足颠倒混匀2min，室温放置10min；1.5、4、10000g（1rpm）离心10min；1.6、小心吸去上清液（注意不要吸起白色沉淀），加入1ml 70%乙醇（-20预冷）旋转漂洗RNA沉淀；1.7、4、10000g（1rpm）离心5min；1.8、小心吸去

20、上清液，空气中干燥2-3min，加入84ul DEPC水充足溶解RNA（如溶解困难，4放置过夜）；将RNA稀释5倍，电泳，（若是对RNA的质量规定不高，做到这一步即可，如下是纯化的环节）依次加入2ul RNase Inhibitor40U/ul，10ul 10DNase I Buffer，4ul DNase I RNase Free5U/ul，充足混匀后37反映60min；1.9、补加200ul DEPC水至总体积300ul，再加入300ul PCI（DEPC水饱和），充足混匀5min，室温10000g（1rpm）离心10min；1.10、小心取上清(几乎看不见中间层，取的较干净)于一新的1.

21、5ml Tube中，再加入300ul CI，充足混匀5min，室温10000g（1rpm）离心10min；1.11、小心取出上清液(几乎看不见中间层，取的较干净)于一新的1.5ml Tube中，加入30ul 3M CH3COONa充足混匀1min后加入750ul无水乙醇（-20预冷），充足混匀2min，-20放置40min；1.12、4、10000g（1rpm）离心15min，小心取出上清（可用枪取干净）；1.13、加入1ml 70%乙醇（DEPC水配制）（-20预冷），旋转振荡清洗RNA沉淀，4、10000g（1rpm）离心10min；1.14、小心吸去上清液，室温干燥2-3min，加入80

22、ul DEPC水溶解；1.15、分别取2ul RNA溶液溶于10ul DEPC水中，混匀后各取出5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳成果鉴定RNA与否有降解；1.16、按照电泳成果估计RNA浓度，按比例使用TE Buffer (PH 8.0) 稀释到0.3至0.5OD吸光度范畴内；二、实验注意事项1.1、整个实验过程中应当使用橡胶手套和口罩，实验前，使用70%乙醇擦拭双手和工作台以及实验用品；1.2、实验用试剂必须保证质量，对pH值有规定的必须以灭菌后的测量值为准；1.3、贵重的样品，抽完之后，必须取出一定量作为实验室保存；1.4、必要时，可以将枪头剪掉一部分使用，以免RNA大量断裂。【PB

23、S溶液的配制使用以及保存措施】一、试剂用途实验中重要用来溶解稀释固体试剂，形成具有缓冲体系的盐离子溶液二、配制，使用和保存措施1、溶液配制按1L的原则量配制称取下列药物：NaCl 8.0gNa2HPO4 1.15gKCl 0.2gKH2PO4 0.2g溶解、定容，使用实验室用超纯水；2、除菌实验室采用过滤灭菌，使用0.22m的除菌膜；4保存。3、使用使用过程中应当保证严格的无菌操作，为了避免污染，可用50ml无菌离心管对dPBS进行分装。 【抗生素配制使用以及保存措施】一、原核细胞用抗生素细胞培养有关实验中，为了避免培养过程中浮现细菌污染，需要在培养基中添加双抗，即青霉素和链霉素。1、药物使用

24、浓度根据细胞种类的不同，一般（P/S）的终浓度保持在100U/ml,具体的实验过程中，可以根据细胞对抗生素的敏感限度减少或增长双抗用量，原则来说，抗生素的使用范畴为：50U/ml-200 U/ml。2、药物配制措施（干粉状的抗生素）2.1、药物溶解使用少量的dPBS溶液溶解干粉状的抗生素，溶解过程中，应尽量减少dPBS的用量，使药物保持在较高浓度；2.2、溶液除菌使用0.22m的除菌膜过滤，然后分装，-20保存。2.3、平常使用按实验规定的终浓度将抗生素溶液添加到培养基当中，注意无菌操作。2.4、注意事项总的原则是现用现配，尽量减少溶液反复冻融次数，避免抗生素失效；培养基最佳是现用现配，在具有

25、血清的完全培养基中，添加抗生素，应4保存且有效有效期不能超过1个月。抗生素并非越多越好，在实验细胞条件不明确之前，应当先从最小使用量开始。二、真核细胞用抗生素本实验室目前常用的真核用筛选标记物重要有两种：neomycin（G418） 和Puromycin，实验中重要用来筛选细胞稳定株或者阳性细胞群落。1、药物配制和保存措施如下：药物保存溶液配制G418Prepared in a highly buffered solution (e.g. 100 mM HEPES, pH 7.3, or cell culture medium).本实验室使用dPBS，pH 7.3固体保存：SHELF (+20

26、C). This product is stable for 2 years液体保存：Following reconstitution, sterilize by filtration through a 0.22m or 0.45 mm pore size filter, aliquot and freeze (-20C) for long term storage or refrigerate (+4C) for short-term storage. assupplied. Sterile stock solutions are stable for at least 1 year at

27、 +4C.Hygromycin BSterile-filtered at 50 mg/ml active antibiotic in PBS; Sterile-filtered at 50 mg/ml active antibiotic in 50mM HEPES, PH7.2. 本实验室使用dPBS，pH 7.3固体保存：Storage at 4，is stable for 2-3years as supplied.PuromycinSoluble in H2O（50 mg/ml）or methanol (20 mg/ml)本实验室使用dPBS，pH 7.3固体保存：Freezer(-20)

28、.Protect from moisture. Following reconstitution,sterilize by filtration through a 0.22 um pore-size filter,aliquot and freeze (-20).This product is atable for 2 years as supplied.液体保存：Stock solutions are stable for up to 3 months at -20.2、平常使用注意事项实验中，应当一方面确认细胞带有抗性；总的原则是现用现配，尽量减少溶液反复冻融次数，避免抗生素失效；培养基

29、最佳是现用现配，在具有血清的完全培养基中，添加抗生素，应4保存且有效有效期不能超过1个月。抗生素在使用之前，应当对细胞细胞相对于抗生素的敏感性进行预实验，拟定药物使用最佳浓度和最佳作用时间，然后开展正式的实验。 【细胞培养基的使用措施】一、 液体培养基产品质量检测实验室在接到产品时，在正式使用之前，应当进行如下质量检测程序1、运送条件：收到培养基之后，先检查运送条件与否合理，正常状况下应当为4运送。2、产品外观：检查封口与否完好，晃动液体，观测溶液与否澄清，正常状况下，溶液应当是澄清，均一的。3、污染物检测：一般在无菌条件下，取5ml培养基于6cm细胞培养皿，于CO2培养箱中条件进培养96小时

30、，定期检查溶液与否边浑浊，正常状况下，溶液应当是始终澄清均仪的。二、完全培养基的配制和使用 1、完全培养基的配制一般状况下，在购买的培养基溶液里添加胎牛血清，抗生素，特殊营养成分等，形成完全培养基。实验室采用的原则如下： FBSP/S谷胺酰氨G418PuroRMPI164010%(体积)100U/ml具有500ng/l300ng/lDMEM10%(体积)100U/ml具有500ng/l300ng/lMEM10%(体积)100U/ml具有500ng/l300ng/lF12/K10%(体积)100U/ml具有500ng/l300ng/l阐明可变可变可变可变可变2、完全培养基的污染物检测一般在无菌条件下，取5ml培养基于6cm细胞培养皿，于CO2培养箱中条件进培养96小时，定期检查溶液与否边浑浊，正常状况下，溶液应当是始终澄清的，实验中，也许会观测到部分絮状物，这个也许是血清中具有的蛋白变性引起的，和实验选择血清的质量密切有关。3、在解决细胞的过程中，应当保证严格的无菌操作，使用之前，最佳进行37预热。4、完全培养基配好之后，尽量及时使用，平时4保存。