生物化学与分子生物学：14-基因工程

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1、王海英课件王海英课件 Genetic Recombination and Genetic Engineering第十四章第十四章 基因重组和基因工程基因重组和基因工程1第一节第一节 自然界自然界DNADNA重组和基因转移重组和基因转移2接合作用接合作用(conjugation)转化作用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transduction)一、细菌的基因转移与重组一、细菌的基因转移与重组3（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNADNA从一个细胞（细菌）转移至从一个细胞（细菌）转移至另一

2、细胞（细菌）的另一细胞（细菌）的DNADNA转移称为转移称为接合作用接合作用(conjugation)。45质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子6可接合质粒如可接合质粒如 F F 因子因子(F factor)7（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNADNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为型，称为转化作用转化作用 (transformation)。8例：溶菌时，裂解的例：溶菌时，裂解的DNADNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。910（三）转导作用（

3、三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的供体细胞与受体细胞之间的DNADNA转移及基因转移及基因重组即为重组即为转导作用转导作用(transduction)。11噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)例例1213（四）（四）、转座、转座由插入序列和转座子介导的基因移位或由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为重排称为转座转座(transposit

4、ion)。14插入序列插入序列(insertion sequences,IS)组成：组成：二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列序列特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 IRTransposase GeneIR发生形式：发生形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)（一）插入序列转座（一）插入序列转座15插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座16转座子转座子(transp

5、osons)可从一个染色体位可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座17由转座子介导的转座由转座子介导的转座18在接合、转化、转导或转座过程中，不同在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNADNA分子间发生的共价连接称基因重组分子间发生的共价连接称基因重组 。二、基因重组二、基因重组同源重组同源重组(homologous recombination)

6、位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)19一、同源重组一、同源重组 (homologous recombination)发生在同源序列间的重组称为同源重组，发生在同源序列间的重组称为同源重组，又称基本重组。是最基本的又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。源序列间进行单链或双链片段的交换。2021以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组的同源重组为例，了解同源重组机制的机制的Holliday模型。模型。22Holliday模型

7、中，同源重组主要模型中，同源重组主要4 4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNADNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNADNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant)23片段重组体片段重组体 （见模型图左边产物）：（见模型

8、图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNADNA。拼接重组体拼接重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNADNA。24 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5

9、3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 25Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体26二、位点特异重组二、位点特异重组位点特异重组位点特异重组(site-specific recombinat

10、ion)是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNADNA序列的特异位点序列的特异位点间发生的整合。间发生的整合。27能否让能否让禾本科的植物禾本科的植物也能够固定空气中的氮？也能够固定空气中的氮？能否让能否让细菌细菌“吐出吐出”蚕丝蚕丝？定向基因改造设想定向基因改造设想 28基因工程的基因工程的原理原理操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程结果结果生物体外生物体外基因基因(或或DNA片段）片段）DNA水平水平剪切剪切拼接拼接 导入导入 表达表达人类需要的新的生物类型人类需要的新的生物类型基因产物基因产物基因重组基因重组DNADNA重组技术重组技术是基因工程的核

11、心技术是基因工程的核心技术29重组重组DNA技术的发展史技术的发展史18651865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验19441944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验19731973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNADNA分子分子19771977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNADNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。19801980年年 开始建造开始建造第一家第一家

12、应用重组应用重组DNADNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂19971997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉30第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 31一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化克隆化(cloning)获取同一拷贝的过程，即获取同一拷贝的过程，即无性繁殖无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆32(1)分子克隆分子克隆(molecular clone),即即DNA

13、 克隆克隆(2)细胞克隆；细胞克隆；(3)个体克隆（动物或植物）。个体克隆（动物或植物）。重组水平重组水平:33DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNADNA）与载体）与载体DNADNA接合成一具有自我复接合成一具有自我复制能力的制能力的DNADNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一转化子细胞，

14、再进行扩增提取获得大量同一DNADNA分子，也称分子，也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。341.1.目的基因的获取目的基因的获取2.2.克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建3.3.外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接4.4.重组重组DNADNA导入受体菌导入受体菌5.5.重组体的筛选重组体的筛选6.6.克隆基因的表达克隆基因的表达二、重组二、重组DNADNA技术基本过程技术基本过程35基因工程的工具酶基因工程的工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNADNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNAT4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸

15、酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶36限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶-限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是是识别识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。Arber、Smith和和Nathans因为在发现限制性内切酶因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。年的诺贝尔奖。37作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰

16、系统，限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。38细菌的限制性核酸内切酶细菌的限制性核酸内切酶DNADNA粘性末端粘性末端细菌自身细菌自身DNA甲基保护甲基保护CH3CH3不工作不工作这种这种限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶有何用呢？有何用呢？打击入侵的敌人打击入侵的敌人39噬菌体噬菌体DNA专一序列点无甲基专一序列点无甲基保护，将被降解。保护，将被降解。40第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序用罗马数字表示

17、发现的先后次序。命名命名EcoR 属属 种种 株株 序序Escherichia coli RY13株株大肠杆菌大肠杆菌 RY13株的第一种酶株的第一种酶41第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶42分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术

18、中常用型）型）已经发现和鉴定了已经发现和鉴定了200200多种多种43类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口44Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口45 被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条两条单链的切口单链的切口，带有几个，带有几个伸出的核伸出的核苷酸苷酸，他们之间正好，他们之间正好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。黏性末端黏性末端46Enz

19、ymes involved in DNA cloningRestriction endonucleases(II)EcolRPstSmal47同功异源酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst48同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性

20、末端称为这两个相同的粘性末端称为配伍未端配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A49重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成

21、双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端

22、磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基501、目的基因、目的基因ncDNA(complementary DNA)体外反转录合成的、与体外反转录合成的、与mRNAmRNA互补的互补的DNADNAn基因组基因组DNA(genomic DNA)代表一个细胞代表一个细胞/生物体整套遗传信息的所有生物体整套遗传信息的所有DNA序列序列（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取511.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序

23、列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)2 2、目的基因的获取方法、目的基因的获取方法52*化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列535455l变性、退火、延伸变性、退火、延伸三步曲三步曲变性变性：双链双链DNADNA解链解链成为单链成为单链DNADNA退火：退火：部分引物与部分引物与模板的单链模板的单链DNADNA的特的特定互补部位相配对定互补部位相

24、配对和结合和结合延伸延伸：以目的基因以目的基因为模板，合成互补为模板，合成互补的新的新DNADNA链链PCRPCR的基本反应步骤：的基本反应步骤：562 2、克隆载体的选择与构建、克隆载体的选择与构建基因载体：基因载体：是运送目的基因片段进入宿主细胞的是运送目的基因片段进入宿主细胞的DNA分子，分子，“分子运输车分子运输车”。57（1 1）能够）能够自我复制自我复制，并带动插入的外源基因一起复制并带动插入的外源基因一起复制（2 2）具有合适的）具有合适的限制性酶切位点（限制性酶切位点（多克隆位点，外源多克隆位点，外源DNADNA插入点）插入点）（3 3）具有合适的）具有合适的筛选标记筛选标记（

25、4 4）细胞内）细胞内拷贝数要多拷贝数要多（5 5）载体的）载体的分子量要小，分子量要小，以容纳较大的外源以容纳较大的外源DNADNA。（6 6）细胞内）细胞内稳定性高稳定性高作为运载体必须具备哪些条件？作为运载体必须具备哪些条件？常用的载体：常用的载体：细菌质粒、细菌质粒、l噬菌体、噬菌体、cosmid质粒等。质粒等。58 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的环状制的环状DNADNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。可以大量增加其拷贝数。1.1.质粒质粒(plasmid)59质粒载体的

26、一般结构60噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列613.粘性质粒粘性质粒(cosmid)62酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，

27、腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他63克隆载体克隆载体(cloning vector)用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变表达载体表达载体(expression vector)在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物载体类型载体类型根据具体实验需要选择载体根据具体实验需要选择载体6465（三）外源基因与载体切割与连接（三）外源基因与载体切割与连接催化连接反应的酶：催化连接反应的酶：DNA连接酶连接酶66DNA连接酶使一段使一段DNA的的3 3

28、-羟基末端与另一段羟基末端与另一段DNA的的5 5-磷酸末端生成磷酸末端生成3 3，5 5-磷酸二酯键，使单链磷酸二酯键，使单链DNA缺口封合或使两个缺口封合或使两个DNA片断连接成一个片断片断连接成一个片断“分子缝合针分子缝合针”67根据酶的来源不同，分为两类：根据酶的来源不同，分为两类：1.1.E.coliDNAE.coliDNA连接酶连接酶：大肠杆菌，只能连接互补：大肠杆菌，只能连接互补的粘性末端。的粘性末端。2 2.T4.T4连接酶连接酶：T4T4噬菌体，既可以噬菌体，既可以“缝合缝合”双链双链DNADNA片段互补的粘性末端，又可以片段互补的粘性末端，又可以“缝合缝合”双链双链DNAD

29、NA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。低。68方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接69Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCC

30、TAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接70不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双

31、酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。712.2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端72目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连733.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)

32、的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。制造出粘性末端，再进行粘端连接。745 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体754.4.人工接头人工接头(l

33、inker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。76人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R77受体菌条件受体菌条件安全宿主菌：安全宿主菌：限制酶和重组酶缺陷：限制酶和重组酶缺陷：处于感受态处于感受态(competent)（四）重组（四）重组DNADNA导入受体菌导入受体菌78大肠杆菌大肠杆菌酵母酵母昆虫细胞昆虫细胞哺乳动物细胞哺乳动物细胞宿主菌或受体细胞感受态细胞（感受态细胞（competent cell）79

34、导入方式导入方式转化转化 (transformation)(transformation)：大肠杆菌大肠杆菌转染转染 (transfection)(transfection)：真核细胞真核细胞感染感染 (infection)(infection)（转导）：病毒（转导）：病毒800.1MCaCl2 容易接受外源容易接受外源DNA的状态的状态感受态细胞感受态细胞8182 (1)抗药性标记选择抗药性标记选择 (2)标志补救标志补救(marker rescue)核酸杂交筛选法核酸杂交筛选法 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹PCR/DNA序列鉴定序列鉴定外源基因表达产物鉴定：外源基因表达产物鉴

35、定：SDS-PAGE、Western blot、ELISA、放免、免疫沉淀、荧光、放免、免疫沉淀、荧光抗体抗体等等遗传标志筛选法遗传标志筛选法（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选83(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择84AmN2H8586 互互补补的的检检测测8788原原位位杂杂交交89Southern印迹印迹 纪念发明者纪念发明者Edward Edward SouthernSouthern（1 1）提取总）提取总DNADNA（2 2）酶解）酶解（3 3）电泳）电泳（4 4）转移到滤膜）转移到滤膜（5 5）变性解链）变性解链（6 6）DNADNA探针及杂交探针及杂交（7 7）

36、洗脱）洗脱（8 8）放射自显影）放射自显影（9 9）比较分析）比较分析9091 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不分离鉴定大小不等的酶解片段：等的酶解片段：磷酸基团带负电荷磷酸基团带负电荷酶解片段酶解片段向阳极移动向阳极移动电场驱动力和凝胶阻力电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率不同迁移率分子量标准参照物分子量标准参照物l 酶切和电泳方法酶切和电泳方法929394分：分：分离目的基因分离目的基因切：切：对目的基因和载体适当切割对目的基因和载体适当切割接：接：目的基因与载体连接目的基因与载体连接转：转：重组重组DNADNA转入受体菌转入受体菌筛：筛：筛选出含有重组体的受菌体筛选出含有重组体的

37、受菌体DNADNA克隆的基本过程克隆的基本过程小小 结结95重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交96表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基

38、因的表达（六）克隆基因的表达971.1.原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白98优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNAcDNA及真核基因组及真核基因组DNADNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表

39、达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染DEAEDEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞99表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱100101三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系n疾病相关基因分析疾病相关基因分析n制造生物活性蛋白质制造生物活性蛋白质n基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗n遗传疾病的预防

40、遗传疾病的预防102 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组

41、织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱103基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。104重症联合性免疫缺陷综合症（SCIDs）。腺苷脱氨酶（ADA）1051.产前诊断产前诊断2.携带者测试携带者测试3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性遗传疾病的预防遗传疾病的预防106小结小结107