临床病理学：组织芯片

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1、组织芯片tissue microarrays TMA 体积小体积小体积小体积小集成度高芯片的特点芯片的特点生物芯片生物芯片v广义的生物芯片（biochip或bioarray）是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。v狭义的生物芯片是指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、组织、抗体、抗原等）固着于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜等固相递质上形成的生物分子点阵。v生物芯片技术又称微阵列（microarray）技术根据固定在载体上的物质成分分类1.基因

2、芯片(gene chip)：又称DNA芯片(DNA chip)或 DNA微阵列(DNA microarray)，是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。2.蛋白质芯片(protein chip或protein microarray)：是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质按微阵列方式固定在微型载体上获得。3.组织芯片(tissue microarrays)：是将组织切片等按照特定的方式固定在载体上。定义定义v组织芯片技术（tissue microarrays TMA）将数十个甚至上千个不同个体的将数十个甚至上千个不同个体的组织标本组织标本按预按预先设计的先设计的顺序排列顺序排列在

3、一张玻片进行分析研究的在一张玻片进行分析研究的方法。方法。v组织芯片 携带有大量不同个体组织及其信息的玻片组织芯片组织芯片v 组织芯直径1mmv 每张芯片集成180个组织芯病理学或生物学需求病理学或生物学需求v病理学家需要将多种组织放在一张切片上对比观察v实验人员需要将同一个体的不同组织放在同一张切片上进行实验v实验人员需要将多个个体样本放在同一张切片上观察或进行原位实验组织芯片的发展史组织芯片的发展史v1986 年Battifora 报道将脱蜡脱水的组织标本手动包裹成香肠形，随机组合，石蜡重新包埋,常规切片，然后用免疫组织化学方法检测同一张玻片上多个组织标本，这是较早的组织芯片的雏形。vmu

4、ltitumor tissue block(MTTB).Battifora H.The multitumor(sausage)tissue block:novel method for immunohistochemical antibody testing.Lab Invest.1986.55(2):244-8.组织芯片的发展史组织芯片的发展史v1991 年Miler等也报道了类似的方法,即将组织条卷成园柱状,石蜡包埋,横向切片,应用于抗体的筛选。v1991年Battifora和Mithta 将组织标本切成细条,分别置于带有沟槽的模具之中,加入琼脂糖凝胶,包埋组织标本,重叠凝胶,石蜡重新包埋

5、,制成多组织切片。组织芯片的发展史组织芯片的发展史v1998年，美国国立卫生研究院国立人类基因组研究所肿瘤遗传学实验室Kononen J等正式提出组织芯片（Tissue microarray TMA）v Kononen J，Bubendorf L，Kallioniemi A，et al，Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens。Nat Med.1998 Jul;4(7):844-7.基本原理基本原理基本原理基本原理组织芯片的介质组织芯片的介质v石蜡（病理科日常使用，最常见）vOCT

6、（新鲜组织，使用少，制作难度大）v塑料（骨髓标本，罕见报道）开展项目开展项目v免疫组化v免疫荧光v原位杂交vFISHv原位PCRv图像分析按组织芯直径分类按组织芯直径分类直径0.6mm1.0mm1.5mm2.0mm直径比值11.672.53.33面积0.28mm20.79mm21.77mm23.14mm2面积比值12.786.2511.11组织芯片的分类组织芯片的分类v按每张芯片上组织芯的数量来分 低密度组织芯片（600）组织芯片的分类组织芯片的分类v 按照组织来源分 人体组织 动物组织 正常组织 疾病组织 胚胎组织 良性肿瘤 恶性肿瘤 非肿瘤疾病 肿瘤组织 肿瘤旁组织 远离肿瘤的正常组织 正

7、常对照组织 治疗前组织 治疗后组织基因芯片原理基因芯片原理v利用碱基互补原理v高通量，高灵敏度，周期短基因芯片的制作基因芯片的制作v自动化程度较高已经批量生产，用于基因病的检测基因芯片使用的注意点基因芯片使用的注意点v高通量获得的信息量大必须采取有效的筛选方法以挖掘有用的信息v高灵敏度样品RNA质量的细微改变可能造成比较结果的不同必须确保样品RNA质量完好v高灵敏度样品中非目的细胞成分会带来很多“噪音”信息必须获得高纯度的目的细胞 组织芯片与其它生物芯片的区别组织芯片与其它生物芯片的区别组织芯片的优势组织芯片的优势优势一优势一v高通量，高效率高通量，高效率 可在12周内完成数千个组织标本中数十

8、个基因或抗原检测 可最大限度的利用有限的标本资源，便于开展交流合作 一张组织芯片检测即可获取大量的生物学信息，而一个制作较好的组织芯片蜡块可以制作上百张组织芯片，可满足数十次实验的需要。优势二优势二v较好的平行性较好的平行性 无论在芯片上进行何种生物学检测，数百例的组织都是在同一张切片上完成操作的，结果更为可靠，更具有可比性 利于结果观察，图像分析等优势三优势三v省时、省力、经济省时、省力、经济制作200病例组织芯片组织芯片检测10个蛋白常规方法检测1个蛋白常规方法检测10个蛋白蜡块准备3-4天2-3天2-3天组织芯片制作1周无无切片2小时4小时左右4*10小时免疫组化2天2天2*10天抗体（

9、一抗、二抗、DAB）100ul*10100ul*200100ul*200*10以制作200位点组织芯片为例优势四优势四v 应用广泛应用广泛1.可用于分子诊断，预后指标筛选、治疗靶点定位、抗体和药物筛选、基因和蛋白表达分析等2.应用于基础病理、组胚、法医等教学工作3.病理实验室质量标准化的控制用途用途 研究工作研究工作v大样本组织中相关基因表达v多种组织来源肿瘤的相关基因表达v同一肿瘤不同发展阶段的相关基因表达状况v组织芯片与基因芯片联合应用用途用途 教学工作教学工作v组织学，病理学，法医等课程学习v组织学，病理学，法医等实践考试用途用途 实验室控制实验室控制v可根据质控的需要设计出各种不同组织

10、芯片v同时对多种不同情况进行检测，如抗体染色是否成功，染色的强弱情况，有没有内源性生物素的干扰等。v作为常规免疫组化的阳性对照和阴性对照对照检测组织如何制作组织芯片？如何制作组织芯片？组织芯片制作流程组织芯片制作流程1.受体蜡块制作2.供体蜡块准备3.芯片布局设计4.点样5.融合蜡块6.切片7.保存8.数据整理和芯片评价受体蜡块制作受体蜡块制作v 选蜡 用于制作组织芯片的石蜡不仅应当具有合适的硬度和透明度，更要有较好的韧性。这是因为组织芯片的制作过程中，针具打孔时对受体蜡块有一定的冲击，易使蜡块出现裂纹，甚是断裂损坏。多种国产普通石蜡韧性差，不适合制作受体蜡块。有文献报道，使用莱卡蜡与蜂蜡混合

11、可有效提高蜡的韧性。我们通过多量实验证明，单独使用蜂蜡（上海华灵，熔点6570）制作受体蜡块，韧性好，硬度高，易于切片。常规二甲苯脱蜡染色后，组织透明度高，免疫组化、原位杂交等实验结果也与普通石蜡无差别。我们换用蜂蜡制作组织芯片后，没有再出现过蜡块制作中损坏的现象。v模具 我们使用专用模具制作组织芯片受体蜡块，制作的蜡块均为27mm27mm6mm，长略小于塑料包埋盒，方便蜡块固定在切片机上。固定模具好处在于方便了芯片布局的设计。Beecher Instruments MTA-1是一台定位高度精密的仪器，在确定组织芯总数、直径、间距和边距后，很容易设计出布局合理的芯片。v灌注蜡块灌注蜡块 灌注蜡

12、块应和常规一样，需在热台上进行。注意：一是避免气泡残留，气泡是导致蜡块与塑料分离，或组织芯松动移位的直接原因。二是注蜡时不可过多，否则会引起蜡块背部不平整，切片时增加初修次数，减少芯片数目。v冷却和成型 灌注好的蜡块在常温下冷却2小时，如模具与蜡块不易分离，可将蜡块放入零下20度冰箱或冷台上冷冻片刻，冻后两者很容易分离。冷冻时间不宜过长，防治蜡块冻裂。然后用切片机对蜡块进行初修，使蜡平面与塑料平面平行，厚度保持在5mm左右。初修后的石蜡平面更为平整，便于点样时调整组织芯的高低。供体蜡块筛选供体蜡块筛选v位置选择位置选择 对供体蜡块进行常规切片和HE染色。显微镜下观察切片，对照蜡块选取合适位置，

13、并用油性笔在蜡块上标记。尽量避免坏死，炎症等对研究无意义的组织。v厚度合适厚度合适 将蜡块放置在观察者与光源之间，估计蜡块中组织的厚度，尽量选择较厚的组织。如组织较薄可多选几处有意义区域，作上记号，点样时，进行叠加操作。v合理使用蜡块资源 手术标本蜡块是一个医院病理科的不可再生的资源，同时也是病理诊断的客观依据。用小标本（如活检标本、穿刺标本及有诊断意义区域少的标本）制作组织芯片，可能会破坏其完整性，应尽量避免使用小标本或在病理科医师指导下合理使用。布局设计布局设计样本位点定位位点定位位点v 组织芯直径组织芯直径 目前已有一个蜡块上集成上千个组织的报道，但研究发现蜡块上超过700个组织芯即排列

14、密度高，难以制作。通常我们制作选择在200500组织芯之间。Beecher Instruments MTA-1配套的点样针有四种规格，即直径0.6mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm。直径越小，集成度越高。使用直径0.6mm的组织芯含细胞数过少，代表性较弱。根据实际经验我们通常选择1mm直径的组织芯，每个蜡块作2个组织芯，但也可以根据具体实验要求调整，选择合适的组织芯直径。另外，打孔针直径越大对受体蜡块的冲击越大，易造成蜡块损坏，制作时需注意。v组织芯的间距与边距组织芯的间距与边距 组织芯间距可与组织芯直径成正比，我们常选用的比例为1：3，即直径0.6mm、1.0mm、1.5mm、2.0m

15、m的组织芯分别选用0.2mm、0.3mm、0.5mm、0.6mm为组织间距。边距即四周组织芯到蜡块边缘的垂直距离，我们选择3mm或以上。间距或边距过短，易引起打孔时蜡块裂纹产生，这是蜡块损坏的前兆。v定位点与定位间隔定位点与定位间隔 目的方便定位，可在蜡块组织芯矩阵左上方起始点上再多加2点组织芯。如果一次实验需制作多个芯片蜡块，还可在不同位置设点，以区别不同芯片。当行或列组织芯数目超过10时，我们考虑加入定位间隔。即每隔一定数量组织芯，其间距适当增加，这样方便观察芯片结果时的位置确定。v编号编号 我们通常水平方向按数字，垂直方向用字母编号，分别从01和a开始。用word作成表单，复印多份，方便

16、原始资料记录。点样v点样时除准备好Beecher Instruments MTA-1自带的调节工具外，还应准备眼科镊，毛刷，刀片等工具。v切片使用进口玻片（或多聚耐氨酸处理后的玻片）点样点样v点样仪的准备 常规固定针具，器械调零后，固定受体蜡块。我们打孔厚度控制在4mm左右，即距离塑料1mm左右。这是因为塑料两侧的蜡通过塑料上的孔连接，如果钻孔过深会损伤连接部分的蜡，造成蜡块分离。可先在打孔针上用直尺量出4mm，用油性笔作记号。打孔时以次为记号，调节钻孔深度。v点样和记录点样和记录 准备完毕后即可按照预先设计的布局进行点样了，并在表单上作相应的记录。供体蜡块上取组织芯的长度不好控制，我们一般尽

17、量取长，长处4cm的组织或蜡，用刀片切去。这里值得我们注意的是，如果你作的芯片希望能长期使用，组织芯一定要保持一定厚度，我们通常希望保证它在3cm以上。组织较薄的蜡块如前述，选择了较多的部位，可以多穿几条组织芯，用刀片切去多余石蜡，用叠加的方法放入孔中，也可保证芯片的长期使用。另外将组织少的芯体，适当埋深，可以减少初修时的损耗。融合蜡块融合蜡块v融合是为了使石蜡和组织芯结合的更为紧密。将蜡块正面向下放在一张干净的玻片上，用胶带稍加固定，放入干燥箱内。v温度设在受体蜡块石蜡熔点以下5，加热约一小时。v实际操作中需多次观测，以石蜡稍融，组织芯尚未移位为准。v取出后常温下冷却，最后将蜡块与玻片分离。

18、切片v常规切片，厚度控制在34um，水域温度控制在40，注意裱片时动作轻柔迅速，防止芯片矩阵偏移。由于芯片多要进行下一步实验，为防止掉片，玻片需用多聚赖氨酸处理。使用进口玻片效果更好，不过价格稍贵。另外由于多次初修会减少芯片数，我们通常一次性大量切片，做好的芯片和蜡块均可放入4冰箱长期保存。制作好的组织芯片制作好的组织芯片保存保存v短期内使用，室温或4冰箱保存v长期保存，蜡块和切片均放置-20低温保存芯片数据整理与评价芯片数据整理与评价v做好标记，整理数据信息v组织芯片由于是将组织高度集成在一张切片上，选材和制作中难免有些偏移或失误，因此我们一般将芯片中不合格的点控制（包括掉片，无意义组织等）

19、在2以下，亦可接收。太多不合格的组织点，带来数据的丢失组织芯片的局限性组织芯片的局限性局限性一局限性一v组织芯片的可靠性和代表性局限 与基因芯片不同,组织芯片虽然也可制成高密度点阵，但其精确性并不与点阵数目呈完全正相关，主要问题是取样点小，在构建肿瘤组织微阵列时所取样本是否正确，并且由于肿瘤细胞存在异质性问题，所取位点不能完全代表肿瘤的全貌。按组织芯直径分类按组织芯直径分类直径0.6mm1.0mm1.5mm2.0mm直径比值11.672.53.33面积0.28mm20.79mm21.77mm23.14mm2面积比值12.786.2511.11高通量组织芯片制作及其免疫组化结果可靠性研究高通量组

20、织芯片制作及其免疫组化结果可靠性研究v 目的目的介绍高通量组织芯片制作技巧，并验证免疫组化结果的可靠性。v 方法方法制作包含600位点，173例肝脏疾病的组织芯片，每个进行PCNA、MDR和HbsAg免疫组化染色。从中随机选取了50例，在其相对应的常规切片上进行同样的免疫染色，对比两者的差异。v 结果结果成功建立高通量组织芯片，每张芯片包含600个位点，密度达到100芯/cm2，位点丢失率在3%以内；组织芯片和常规切片中PCNA、MDR和HBsAg表达的一致率分别为92、92和98%，Kappa系数分别为0.83，0.83和0.95。v 结论结论通过技术水平的提高，可以制作较高质量的高通量组织

21、芯片。在此基础上，2个直径0.6mm的肝脏疾病组织芯片，可以有效、可靠的进行免疫组化检测。陈骏,吴鸿雁,孟凡青,等.高通量组织芯片制作及其免疫组化结果可靠性研究J.南京医科大学学报,2006,26(8):734-6.PCNA、MDR、HbsAg免疫组化在组织芯片和免疫组化在组织芯片和常规切片中的结果常规切片中的结果 组织芯片中常规切片中结果一致例数结果不一致例数符合率Kappa值阳性阴性PCNA阳性27146492%0.836阴性319MDR阳性28246492%0.833阴性218HBsAg阳性16049198%0.955阴性133组织芯片制作前组织芯片制作前v多点取材（23点）v不要一味追

22、求芯片中组织芯的数量v根据实验对象和样本量选取组织芯直径局限性二局限性二v病理组织标本的来源少v供体蜡块受到破坏，且不可再生局限性三局限性三v组织芯片制备为手工操作，后期结果观察主要为人工观测，比较费精力。v实验得到的海量数据如何存储统计？肝细胞性肝癌中MCP-1的表达与血管新生的关系v 目的目的检测MCP-1在肝细胞性肝癌中表达的状况，分析其与肿瘤血管新生的关系。v 方法方法制作包含36例非肿瘤肝疾病和109例HCC肿瘤及癌旁组织的组织芯片，运用免疫组化的方法检测MCP-1，VEGF，CD68的表达情况；运用CD34标记肿瘤血管，进行微血管密度计数。v 结果结果MCP-1在HCC，癌旁和非肿

23、瘤肝疾病中的表达率分别为40.4%、67.0%和44.4%。HCC中MCP1与VEGF（r0.233，p=0.015）和MVD（r0.234，p=0.014）均有相关性，MCP-1的表达情况与肿瘤的病理分期亦有相关性（p0.05），而与肿瘤的大小，数目，分化，肝硬化和预后无显著相关性。v 结论结论MCP-1通过诱导VEGF的表达增强促进HCC血管新生，但MCP-1不能作为提示HCC预后的指标。陈骏,孙喜太,丁义涛,孟凡青,吴鸿雁.肝细胞性肝癌中MCP-1的表达与血管新生的关系J.南京医科大学学报,2007,27(2):133-6 v 研究对象收集南京大学医学院附属鼓楼医院病理科20022004

24、年存档的肝脏疾病石蜡标本共160例。其中包括HCC 116例，肝硬化18例，肝内胆管结石17例，肝外伤3例，肝囊肿3例，其它非肿瘤肝疾病3例。研究对象分为三组：肿瘤组，癌旁组（肿瘤周围2cm内肝组织），和非肿瘤肝疾病组。收集相应临床病理资料。v TMA构建首先对照常规HE切片，在蜡块上选取合适的靶位点，HCC肿瘤组织尽可能远离坏死、出血部位，癌旁组织选取距肝癌组织2cm内的正常肝组织。用Beecher Instruments MTA-1组织芯片点样仪（美国）制作组织芯片，点样针直径为1mm（仪器配套）。点样时，从非肿瘤肝疾病组织、HCC和癌旁肝组织各取两条，移入受体蜡块。共制作组织微阵列3个，

25、每个阵列包含180条组织芯，共540个位点。其中HCC116例232个位点，癌旁组织110例220个位点，非肿瘤肝疾病44例88个位点，融合冷却后按4m厚度连续切片。v 测评标准根据抗原不同，在细胞靶部位显棕色颗粒或均匀着色者方为阳性细胞。少于5靶细胞阳性记录为阴性（）；550靶细胞为弱或中等程度着色记录为（），即弱阳性；大于50靶细胞中等程度着色或大于5靶细胞成深棕色着色记录为（），即强阳性。两个位点如评分不一致，则记录阳性强的评分，取代弱阳性、阴性或丢失的位点。Au NH,Cheang M,Huntsman DG,et al.Evaluation of immunohistochemica

26、l markers in non-small cell lung cancer by unsupervised hierarchical clustering analysis:a tissue microarray study of 284 cases and 18 markersJ.J Pathol,2004;204(1):101-9.v 统计方法对免疫组化结果进行统计分析，采用秩和检验统计HCC，癌旁和非肿瘤肝疾病组间的差异，同法分析MCP-1在HCC中的表达与临床病理资料的关系。对患者进行随访，采用Kaplan-Meier法分析MCP-1表达情况对患者生存率的影响。以上统计均采用SPS

27、S 11.5软件进行运算处理。v芯片构建和HE、免疫组化染色结果观察芯片完成后，经观测共145例（非肿瘤肝疾病组织36例，HCC和癌旁组织109例）有效，有效率为94.1%。16对32个位点数据被剔除，原因有：临床病理资料不完整，9对。位点丢失或镜下为炎症坏死组织，可导致相关因子检测结果无意义，7对。HE染色情况良好，同普通切片HE染色结果。非肿瘤肝疾病中有22例伴有肝硬化及相关炎症，占总数的61.11%，109例癌旁组织中有72例伴有肝硬化，占总数66.05。免疫组化结果显示：MCP-1的阳性表达可见于HCC肿瘤细胞、间质细胞和肝细胞胞浆内；VEGF表达于HCC和肝细胞胞浆内；CD68表达于

28、单核巨噬细胞胞浆中；CD34定位于血管内皮细胞胞浆。MCP-1、VEGF、CD68在各组中的表达情况在各组中的表达情况 非肿瘤肝疾病组（1组）癌旁组（2组）HCC组（3组）P值(-)(+)(+)阳性率(-)(+)(+)阳性率(-)(+)(+)阳性率1组与2组比较1组与3组比较2组与3组比较MCP-1208844.4%36254867.0%65261840.4%0.010.5620.01VEGF293419.4%48115056.0%46313257.8%0.010.010.256CD68822677.8%3743297.2%8782392.7%0.010.0800.073HCC中中MCP-1的

29、表达与临床病理资料的关系的表达与临床病理资料的关系 MCP-1表达P值(-)(+)(+)性别男5622150.751女943肿瘤数目单发3317100.372多发3298肿瘤大小5cm45158分化程度高分化2310.431中分化521916低分化1041癌栓无301890.233有3589病理分期、级3117140.05、级3494肝硬化无25930.141有401715展望展望v 美国国家人类基因研究所和美国国家癌症研究所共同提出了所谓“组织微阵列研究计划”(tissue array research program,TRAP),以推动组织芯片技术的发展和应用。数字切片简介数字切片简介 数

30、字切片（即虚拟切片）并非一张静态图片，数字切片（即虚拟切片）并非一张静态图片，它是包含了玻璃切片上的所有病变信息，此数它是包含了玻璃切片上的所有病变信息，此数字切片（超大空间、高分辨率图片）可以在电字切片（超大空间、高分辨率图片）可以在电脑上进行任意的放大和缩小，并切片利用数字脑上进行任意的放大和缩小，并切片利用数字切片可以观测到玻璃切片上的任何一个位置，切片可以观测到玻璃切片上的任何一个位置，也可以将相应的位置放大到也可以将相应的位置放大到5倍、倍、10倍、倍、20倍、倍、40倍，如同在显微镜上的放大缩小一样。倍，如同在显微镜上的放大缩小一样。TMA处理软件处理软件v Tissue Arra

31、y Database:(MD ANDERSON CANCER CENTER)v Tissue Microarray Core:(John Hopkins Pathology)v TMA Software:(Stanford Genomic Resources)v TMALab Software:(Aperio Technologies)v TMAx:(Beecher Instruments)v Discovery TMA:(Molecular Devices)v TMAscore:(Bacus Laboratories,Inc.,)组织芯片的进展组织芯片的进展聚类分析聚类分析 v聚类分析指将物理或抽象对象的集合分组成为聚类分析指将物理或抽象对象的集合分组成为由类似的对象组成的多个类的分析过程。由类似的对象组成的多个类的分析过程。v衡量不同数据源间的相似性，以及把数据源分衡量不同数据源间的相似性，以及把数据源分类到不同的簇中。类到不同的簇中。总结总结v什么是组织芯片v组织芯片的优势v如何制作组织芯片v组织芯片的局限性v试验中如何应用