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1、原核表达载体的重要调控元件启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调 控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达 载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点 上游510 bp处，有一段由68个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow盒，又名TATA盒或一 10区。来源不同的启动子，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由 10 bp组成的区域，称为-35区。
2、转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶 使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的 杂合启动子)、lPL(l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。(1) Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白 基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利
3、用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受 分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合 阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从 而解除这种阻遏，诱导转录发生。(2) trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨 酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻
4、遏蛋 白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。(3) Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调 节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的一35区加上一个合成的46 bp DNA片 段(包括Pribnow盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。(4) lPL启动子：它来自l噬菌体早期左向转录启动子，是一种活性比Trp启动子高11倍左右的强启动子。 lPL启动子受控于
5、温度敏感的阻遏物clts857。在低温(30C)时，clts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在 高温(45C)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL启动子转录。系统由于受cIts857作用，尤其适合于 表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换不仅可诱导PL启动子，也可诱导热休克基因，其中有一 些热休克基因编码蛋白酶。如果用l噬菌体cl+溶源菌，并用丝裂霉素C或萘啶酮酸进行诱导，可缓解这一 矛盾。(5) T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其 启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高
6、5倍左右，它 能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大 肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因。但要注意用这 种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。应用T7噬菌体表达系统需要2个条件：第一是具有T7噬菌 体RNA聚合酶，它可以由感染的l噬菌体或由插入大肠杆菌染色体上的一个基因拷贝产生；第二是在一个 待表达基因上游带有T7噬菌体启动子的载体。2SD 序列1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位 于AUG上游310 bp处的由39
7、bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸，冈妝子与16S rRNA 3末端的 富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称 SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质 与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码 子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。3 终止子在一个基因的 3末端或是一个操纵子的 3末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一 序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再 前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起 强终止作用的终止子在结构上有一些共同的特点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域，G/C 富含区域又具有回文对称结构。这段终止子转录后形成的RNA具有茎环结构，并且有与A/T富含区对应 的一串U。转录终止的机制较为复杂，并且结论尚不统一。但在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的 rrB 核糖体 RNA 的转录终止子
原核表达载体的重要调控元件
