基因重组与基因工程技术课件

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1、重组重组DNA技术技术-基因重组与基因工程基因重组与基因工程 基因工程亦称遗传工程，即利用基因工程亦称遗传工程，即利用DNADNA重组重组技术的方法，把技术的方法，把DNADNA作为组件，在细胞外将一作为组件，在细胞外将一种外源种外源DNADNA（目的基因）和载体目的基因）和载体DNADNA重新组合连重新组合连接（重组），最后将重组体转入接（重组），最后将重组体转入宿主宿主细胞，使细胞，使外源基因外源基因DNADNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（增殖（cloningcloning，克隆），或最后得到表达，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有

2、的遗传最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。性状。技术的诞生。伯格因此获得了技术的诞生。伯格因此获得了。科恩随后以科恩随后以DNADNA重组技术发明人的身份向美重组技术发明人的身份向美国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术国专利局申报了世界上第一个基因工程的技术专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中专利。这标志着自然界不同物种间在亿万年中形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己形成的天然屏障被打破了，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造的意愿定向地改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型。新的生命类型。19771977年，吉尔伯特（年，吉尔伯特（WGilbert

3、WGilbert）分别将编分别将编码胰岛素和干扰素的码胰岛素和干扰素的DNADNA经过体外重新拼接后，经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成了胰岛素和干扰素。素和干扰素。DNA重组的基本模式重组的基本模式总体技术路线总体技术路线从基因所在生物直接取得从基因所在生物直接取得化学合成法化学合成法人工合成：人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段编码小分子多肽的基因。较短的核酸片段

4、（60-80bp60-80bp）多肽链的氨基酸顺序多肽链的氨基酸顺序mRNA的碱基排列顺序的碱基排列顺序相应的基因结构相应的基因结构化学合成目的基因化学合成目的基因化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的化学合成的最大优点是可以合成一些分离较困难的基因。基因。化学合成的不足之处在于：化学合成的不足之处在于：-要已知基因的核苷酸顺序；要已知基因的核苷酸顺序；-基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基基因不能太大，这一方面是测定核苷酸（或氨基酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成酸）顺序比较困难，另一方面是因为每次仅能合成几百的短片段，短片段越多，要连接成正确的几百的短片段，短片段越多

5、，要连接成正确的基因顺序就越困难，得率越低；基因顺序就越困难，得率越低；-价格昂贵。价格昂贵。用途：用途：PCRPCR引物引物,测序引物测序引物,定点突变定点突变,核酸杂交探针核酸杂交探针从基因文库中筛选从基因文库中筛选将某一种基因将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与用适当的限制酶切断后，与载体载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组全部基因组DNA的种群，称为的种群，称为G文库文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种然后转

6、化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为群，称为C-文库文库(cDNA library)。C-文库具有文库具有组织细胞特异性。组织细胞特异性。从从mRNA反转录合成反转录合成cDNA构建基因文库获取目的构建基因文库获取目的基因存在的问题基因存在的问题费时费事费时费事内含子序列内含子序列反转录人工合成互补反转录人工合成互补DNA方法的优势方法的优势 获取的获取的DNA片段往往是片段往往是 具有特定功能的目的基因具有特定功能的目的基因聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）如已知目的基因两如已知目的基因两端的序列，则可采端的序列，则可采用聚合酶链

7、反应技用聚合酶链反应技术，在体外合成目术，在体外合成目的基因。但此法可的基因。但此法可能会造成克隆的目能会造成克隆的目的基因碱基序列的的基因碱基序列的改变。改变。载体载体DNA的选择的选择理想载体的基本条件：理想载体的基本条件：可转移性可转移性,为目的基因提供进入受体细胞的为目的基因提供进入受体细胞的转转移移能力。能力。合适的复制位点合适的复制位点,为目的基因提供在受体细胞为目的基因提供在受体细胞中的中的复制能力或整合能力复制能力或整合能力。多克隆位点：广泛、特异多克隆位点：广泛、特异选择标志，便于筛选和鉴定选择标志，便于筛选和鉴定分子较小，可容纳较大的外源分子较小，可容纳较大的外源DNA质粒

8、质粒噬菌体噬菌体腺病毒载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体种类：种类：质粒载体的一般结构质粒载体的一般结构存在于细菌存在于细菌染色体外的染色体外的小型环状小型环状DNADNA分子。分子。具有具有自我复自我复制制功能。功能。带有抗性基带有抗性基因及表型识因及表型识别等别等遗传性遗传性标记物标记物。经改造后具经改造后具有有多克隆位多克隆位点。点。DNA重组的基本模式重组的基本模式载体和目的基因的切断载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体简称限制酶，分别对载体DNA和目的基因进行切断，以便

9、于重组。和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序多种，所识别的顺序往往为往往为4-8个碱基对，且有回文结构。个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出突出粘性末端和粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成突出粘性末端三种情况。形成粘性末端粘性末端(cohesive end)者较有利于载体者较有利于载体DNA和目的基因的重组。和目的基因的重组。酶切酶切 -双酶切：双酶切：体系体系：选择合适的缓冲体系，尤其是双酶切反应中。：选择合适的缓冲体系，尤其是双酶切反应中。DNA：经过纯化的，尽量不含有

10、蛋白质，酒精等：经过纯化的，尽量不含有蛋白质，酒精等杂质。杂质。时间时间：一般为：一般为5-7h，载体，载体overnight以保证酶切完全。以保证酶切完全。不能时间过长，以防止内切酶的不能时间过长，以防止内切酶的star活性，降低特活性，降低特异性。异性。酶切之后立即回收，小片段用酶切之后立即回收，小片段用PCR-purification Kit 除去，除去，大的片段要用切胶回收去除。大的片段要用切胶回收去除。T-vectorT-vector两条链的两条链的5端含有一个游离的端含有一个游离的TPCR过程中，普通的过程中，普通的Taq酶可在产物的酶可在产物的3端多加一个端多加一个ADNA重组的

11、基本模式重组的基本模式（一）粘性末端连接法：（一）粘性末端连接法：当载体当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。接。载体载体DNA与目的基因的连接与目的基因的连接（二）人工接尾法：（二）人工接尾

12、法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上端，如载体上添加一段添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，故二者即可通过碱基互补进

13、行粘合，再由再由DNA连接酶连接。连接酶连接。末端转移酶（末端转移酶（terminal transferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），），它所催化的反应与它所催化的反应与DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有以含有的片段为引物，在的片段为引物，在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在端加入核苷酸达几百个。末端转移酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。末端。（三）人工

14、接头连接法：（三）人工接头连接法：将人工连接器（将人工连接器（linker，即一段人工合成的含有，即一段人工合成的含有多种限制酶切点的小分子多种限制酶切点的小分子DNA片段，约片段，约1020个个核苷酸）连接到平末端核苷酸）连接到平末端DNA分子分子(载体和目的基载体和目的基因因)上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。点。连接体系的建立：连接体系的建立：温度：粘末端连接：温度：粘末端连接：1

15、2-18(16-20 hours)平末端连接：室温（低于平末端连接：室温（低于30)DNA量：载体分子数量：载体分子数/目的基因分子数目的基因分子数=1：3-5酶量：平端连接时需加大酶量酶量：平端连接时需加大酶量 连接反应体系越小越好，相对而言，酶切体系稍大连接反应体系越小越好，相对而言，酶切体系稍大较好较好连接失败后连接失败后-一步一步向上游检测问题所在，所以分子一步一步向上游检测问题所在，所以分子 克隆部分克隆部分“留一半留一半”的原则有时候是很有用的。的原则有时候是很有用的。酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。酶切是否完全，所以要做载体的自连对照。载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小，

16、载体酶切回收是否考虑到切除片段的大小，是否要用切胶回收更保险。是否要用切胶回收更保险。DNA重组的基本模式重组的基本模式宿主菌或受体细胞宿主菌或受体细胞原核系统原核系统 -大肠杆菌大肠杆菌 -枯草杆菌枯草杆菌真核系统真核系统 -酵母菌酵母酵母菌酵母 -昆虫细胞昆虫细胞 -哺乳动物细胞哺乳动物细胞原核细胞的转化（细菌转化）原核细胞的转化（细菌转化）限制缺陷型限制缺陷型:避免修饰和降解避免修饰和降解重组缺陷型：重组缺陷型：避免重组整合避免重组整合转化亲和型：转化亲和型：较高的可转化性较高的可转化性遗传互补型：遗传互补型：利于筛选利于筛选感染缺陷型：感染缺陷型：防止感染防止感染感受态细胞感受态细胞（

17、competent cell）所谓感受态，所谓感受态，就是细菌吸收转化因子的生理状就是细菌吸收转化因子的生理状态。态。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后等化学试剂法）的处理后,细胞膜的通透细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（分子进入的感受态细胞（Competent cells）。）。大肠杆菌感受态

18、细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备(化学方法化学方法)大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞CaClCaCl2 2处理处理 目前常用的感受态细胞制备方法是目前常用的感受态细胞制备方法是CaCl2法法,CaCl2 法简便易行法简便易行,且其转化效率完全可以满足且其转化效率完全可以满足一般实验的要求一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用制备出的感受态细胞暂时不用时时,可加入占总体积可加入占总体积15的无菌甘油于的无菌甘油于-70保存保存(半年半年),因此因此CaCl2法为使用更广泛。法为使用更广泛。一、一、受体菌的培养受体菌的培养 从从LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活

19、化的E.coli DH5单菌落单菌落,接种于接种于3-5ml LB液体培养基中，液体培养基中，37下振荡培养下振荡培养12小时左右小时左右,直至对数生直至对数生长后期。将该菌悬液以长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于的比例接种于100ml LB液液体培养基中，体培养基中，37振荡培养振荡培养2-3小时至小时至OD600 0.5左右。左右。二、二、感受态细胞的制备感受态细胞的制备(CaCl2 法法)将培养液转入离心管中将培养液转入离心管中,冰上放置冰上放置10分钟，然后于分钟，然后于4下下3000g离心离心10分钟。分钟。弃去上清弃去上清,用预冷的用预冷的0.05 mol/L的的

20、CaCl2 溶液溶液10ml轻轻悬浮轻轻悬浮细胞细胞,冰上放置冰上放置15-30分钟后，分钟后，4下下3000 g离心离心10分钟。分钟。弃去上清弃去上清,加入加入4ml预冷含预冷含15%甘油的甘油的0.05 mol/L的的CaCl2 溶溶液液,轻轻悬浮细胞轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成感受态细胞分装成200l的小份的小份,贮存于贮存于-70可保存半年。可保存半年。感受态细胞的制备的操作步骤感受态细胞的制备的操作步骤 为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要实验中要考虑以下几个重要因素：因素：细胞生长状态和

21、密度细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的的培养菌，最好从培养菌，最好从70或或-20甘油保存的菌种中直接转甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。来控制。DH5菌株的菌株的OD600 为为0.5时时,细胞密度在细胞密度在5107 个个/ml左左右右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。或不足均会影响转化效率。试剂的

22、质量试剂的质量:所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的(GR.或或AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗最好分装保存于干燥的冷暗处。处。防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行件下进行,所用器皿所用器皿,如离心管如离心管,tip头等经高压灭菌处理头等经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或酶或杂杂DNA所污染所污染,否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入,为以后的筛选、鉴定带来

23、不必要的麻烦。为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。大肠杆菌细胞大肠杆菌细胞大肠杆菌感受态细胞大肠杆菌感受态细胞得到噬菌斑或单菌落得到噬菌斑或单菌落与重组与重组DNADNA共同冰浴共同冰浴而后而后4242短暂热刺激短暂热刺激CaClCaCl2 2处理处理50-100mmol/LCaCl2 转转 化化从从-70冰箱中取冰箱中取200l感受态细胞悬液感受态细胞悬液,室温下使其解冻，解室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。冻后立即置冰上。加入加入pBS质粒质粒DNA溶液溶液(含量不超过含量不超过50 ng,体积不超过体积不超过10l)，轻轻摇匀，冰上放置轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。分钟后。42水浴中热击

24、水浴中热击90秒或秒或37水浴水浴5分钟，热击后迅速置于冰分钟，热击后迅速置于冰上冷却上冷却3-5分钟。分钟。向管中加入向管中加入1ml LB液体培养基液体培养基(不含不含Amp)，混匀后，混匀后37振荡振荡培养培养1小时，使细菌恢复正常生长状态小时，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗并表达质粒编码的抗生素抗性基因生素抗性基因(Ampr)。将上述菌液摇匀后取将上述菌液摇匀后取100l 涂布于含涂布于含Amp的筛选平板上，正的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿皿,37培养培养16-24小时。小时。计算转化率

25、。计算转化率。转化的操作步骤转化的操作步骤 为了提高转化效率为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因实验中要考虑以下几个重要因素：素：用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源入的外源DNA的量过多或体积过大时的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。1 ng的的cccDNA即可使即可使50l 的感受态细胞达到饱和。当所的感受态细胞达到饱和。当所转化的很难得时（如用从相对难得的样品中提取转化的很难得时（如用从相对难得的样品

26、中提取mRNA而合成的而合成的cDNA),这就显得格外重要。这就显得格外重要。一般情况下一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。对照实验对照实验E.coli的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，的电穿孔转化：在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高23个数量级。个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染。这种方法也可用于真核生物的转染。转化方法转化方法真核细胞的转染真核细

27、胞的转染受体细胞系统受体细胞系统 永生细胞系永生细胞系 细胞特异性的选择标记细胞特异性的选择标记电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。电穿孔法：原理与原核生物的电穿孔法一样。磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将磷酸钙转染技术：主要用于动物细胞的转染。将DNA溶液加溶液加入到入到CaCl2中，然后在强烈震荡下加入由中，然后在强烈震荡下加入由Na2HPO4和和NaH2PO4组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将组成的磷酸缓冲液，使溶液产生磷酸钙沉淀并将DNA包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的包裹在沉淀中。将这些沉淀加入到细胞中，利用细胞的胞饮作用将胞饮作用将DNA导入到细

28、胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞导入到细胞中。磷酸钙一方面可以增加细胞的通透性，一方面可以避免的通透性，一方面可以避免DNA被细胞内的核酸酶水解。被细胞内的核酸酶水解。转染方法转染方法基因枪转染法：基因枪转染法：利用被电场或机械加速的金属微粒能够利用被电场或机械加速的金属微粒能够进入细胞内的基本原理，先将进入细胞内的基本原理，先将DNA溶液与钨、金等金属溶液与钨、金等金属微粒一起保温，使微粒一起保温，使DNA吸附在金属微粒表面，随高速的吸附在金属微粒表面，随高速的金属微粒直接进入细胞内。金属微粒直接进入细胞内。激光微束穿孔法：激光微束穿孔法：利用直径很小、能量很高的激光束在利用直径很小、能量很高

29、的激光束在细胞表面引起可逆性的穿孔，使细胞表面引起可逆性的穿孔，使DNA进入细胞。进入细胞。显微注射法：显微注射法：利用毛细管直接将利用毛细管直接将DNA注入细胞内。注入细胞内。脂质体（脂质体（liposome）介导法：）介导法：将将DNA包裹在人工制备的磷包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将而将DNA导入细胞内。导入细胞内。多聚物介导法：多聚物介导法：利用多聚物如利用多聚物如PEG、二乙胺乙基葡聚糖、二乙胺乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳葡聚糖）、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等与二价阳离

30、子、离子、DNA混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而混合形成沉淀颗粒，通过细胞的胞饮作用而进入细胞内。进入细胞内。DNA重组的基本模式重组的基本模式阳性重组子的阳性重组子的鉴定鉴定遗传检测法遗传检测法(根据重组载体的标志作筛选根据重组载体的标志作筛选)-插入失活法插入失活法 -互补法互补法限制性酶切法限制性酶切法PCR法法杂交筛选法杂交筛选法免疫学方免疫学方 法法核苷酸序列测定法核苷酸序列测定法 遗传检测法遗传检测法菌株为某种抗菌株为某种抗生缺陷型，生缺陷型，而而质粒上带有该质粒上带有该抗性基因（如抗性基因（如氨苄青霉素，氨苄青霉素，卡拉霉素等）卡拉霉素等）这样只有转化这样只有转化子才能在含

31、该子才能在含该抗生素的培养抗生素的培养基上长出。基上长出。对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭插入灭活法活法进行筛选。如进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。的细菌即为带

32、重组体的细菌。如果外源如果外源DNA插入，插入，氨卞青霉氨卞青霉素抗性基因失活素抗性基因失活如果外源如果外源DNA插插入，入，四环素抗性四环素抗性基因失活基因失活pBR322pBR322质粒结构质粒结构pBR322AmpTet-互补法互补法蓝白筛选蓝白筛选现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）的）的调控序列和调控序列和N端个氨基酸偏码区（全长端个氨基酸偏码区（全长1201氨基酸）氨基酸）。这个编码区中插入一个多克隆位点。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌是受体

33、菌是Z基因突变型，只含编码基因突变型，只含编码半乳糖苷酶端半乳糖苷酶端aa的的序列。当外源基因插入时，在序列。当外源基因插入时，在IPTG（异丙基硫代（异丙基硫代-D-半乳半乳糖苷）诱导下合成糖苷）诱导下合成半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端片断，和受体菌的端片断，和受体菌的C端端片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的片断溶为一体后，可产生蛋白质间的互补，形成有活性的半乳糖苷酶，称半乳糖苷酶，称互补。互补。具有具有互补的细菌培养在含互补的细菌培养在含IPTG及及X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷）的培养基上。半乳糖苷）的培养基上。X-gal本身是无色的，在半乳本身是无

34、色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的深兰色的5-溴溴-4-氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。氯靛兰），因此会形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入突变失活，则不能产生则不能产生互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区互补，因此菌落是白色的。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。分重组子和非重组子。IPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。高于乳糖。-互补互补法法限制性酶切法

35、限制性酶切法 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。有目的基因。凝胶凝胶电泳检测电泳检测PCR法法利用的目标引物利用的目标引物(例如分离目的基因所使用的引例如分离目的基因所使用的引物

36、物)，抽提需要筛选的克隆的重组，抽提需要筛选的克隆的重组DNA作为模板作为模板,进行进行PCR扩增扩增,根据是否扩增出目的片段来确定阳根据是否扩增出目的片段来确定阳性克隆。性克隆。杂交筛选法杂交筛选法为了进一步鉴定重组基因体为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的的基因部分互补的DNA片段片段作为探针，与含有重组体的作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。可确定重组体中带目的基因。32P标记的标记的DNA分子探针分子探针杂交杂交放射自显影法放

37、射自显影法依据：碱基互补配对原则依据：碱基互补配对原则步骤：步骤：合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记）并用同位素标记）升高温度或改变升高温度或改变pH使使DNA变性变性 分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。片段即含有所需基因。分子杂交分子杂交免疫化学检测法免疫化学检测法滤滤膜（固定抗体）膜（固定抗体）+DNA序列分析法序列分析法该方法通常是用在目的基该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴

38、定。因筛选后最终的鉴定。ACTGAAGGCT真核细胞的筛选真核细胞的筛选新霉素抗性选择系统：新霉素抗性选择系统：新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在能在真核细胞中表达并能使真核细胞中表达并能使G418失活（失活（neo基因编码一基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。个磷酸转移酶），细胞可以生长。真核细胞的筛选标记真核细胞的筛选标记AmPoritk-细胞突变株筛选转染细胞细胞突

39、变株筛选转染细胞选择原理：选择原理：tk(胸苷激酶胸苷激酶)基因的筛选：受体细胞必须是相基因的筛选：受体细胞必须是相应的应的tk-，将细胞培养在含，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，黄嘌呤，A：氨甲喋呤，氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在胸苷）的培养基中。在A存存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成成AMP、TMP及及GMP。这三种核苷酸的合成这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有只能有补偿途径合成，必须具有tk基因的存在基因的存在细胞才可生长。细胞才可生长。(HAT选择)DNA重组的基本模式重组的基本模式外源基因在宿主细胞中的表达外源基因

40、在宿主细胞中的表达原核生物基因结构和表达特点原核生物基因结构和表达特点原核生物染色体原核生物染色体DNA是裸露的环形是裸露的环形DNA，其转其转录和翻译是偶联的连续进行。录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。一般不含内含子（一般不含内含子（intron），没有转录及翻译），没有转录及翻译后加工系统。后加工系统。原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。操纵子是一组功能上相关，受同一调操纵子。操纵子是一组功能上

41、相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。控区控制的基因组成的一个遗传单位。原核生物中参与转录的基因结构：原核生物中参与转录的基因结构：启动子启动子(promoter,P)是指能被是指能被RNA聚合酶识聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。序列。一般长一般长40-60bp，富含，富含A-T碱基对碱基对 具有保守序列：具有保守序列：-10区（区（pribnow box）：）：TATAAT -35区：区：终止子（终止子（terminator，T）:位于基因位于基因3端端,给予给予RNA聚合酶转录终止信号的聚合酶转录终止信号的DNA序列序列 与翻译有关的原

42、核细胞结构：与翻译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点核糖体结合位点 翻译起始密码子翻译起始密码子AUG 或或GUG SD顺序（顺序（shine-dalgarno）：）：AUG上游上游3-11 bp 长约长约3-9bp mRNA与与16s核糖体亚基间的识别与结合序列核糖体亚基间的识别与结合序列 人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长传背景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有几十年的经验积累，大肠杆菌表

43、达外源基达工具已有几十年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因设计外源基因在大肠杆菌表达就需要外源基因在大肠杆菌中表达所需要的元件，在大肠杆菌中表达所需要的元件，包括转录起始必需包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列等；外等；外源基因表达的产物可能会对大肠

44、杆菌有毒害作用，会源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱诱导性表达所需要的元件导性表达所需要的元件，即有，即有操纵子序列以及与之配操纵子序列以及与之配套的调控基因套的调控基因等；外源基因还应当插入到适合于表达等；外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点多克隆位点；此外还应此外还应具备基因克隆筛选的条件具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复，包括在细胞中复制必需的制必需的复制起始序列、筛选标志复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等。如

45、抗药性基因等。外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和删除内含子和5非编码区非编码区外源基因置于强启动子和外源基因置于强启动子和SD顺序控制下顺序控制下维持正确开放阅读框架（维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 原核表达载体原核表达载体(expressing vector)特点：带表达构件特点：带表达构件转录和翻译所需的转录和翻译所需的DNA序列序列大肠杆菌表达载体：含启动子大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位核糖体结合位点点克隆位点克隆位点转录终止信号转录终止信

46、号启动子：启动子：trp-lac(tac)启动子、启动子、噬菌体噬菌体PL启动子、启动子、T7噬菌体启动子噬菌体启动子核糖体结合位点核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子起始密码子(ATG)和和SD序列序列转录终止序列转录终止序列影响外源基因在原核细胞中表达影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：效率的因素：启动子的选择和改造启动子的选择和改造 强启动子强启动子 可调控启动子可调控启动子P启动子：建立表达载体时，选择强启动子。启动子：建立表达载体时，选择强启动子。启动子最佳作用距离启动子最佳作用距离-转录起始点转录起始点常见原核强启动子：常见原核强启动

47、子：Plac：受：受Lac阻遏蛋白负调，受阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和启动子和Trp启动子的杂合启动子。启动子的杂合启动子。PL和和PR启动子：噬菌体早期左启动子：噬菌体早期左/右向启动子，右向启动子，受受噬菌体噬菌体CI基因负调控。温度诱导。基因负调控。温度诱导。Promoters for E.coli终止子：终止子：强终止子、二聚体终止子强终止子、二聚体终止子转录过度转录过度 影响目的基因的转录和翻译效率影响目的基因的转录和翻译效率 干扰基因载体的复制等生物学功能干扰基因载体的复制等生物学功能 增

48、加受体细胞的无效能量消耗增加受体细胞的无效能量消耗 SD序列：影响翻译效率序列：影响翻译效率SD序列与序列与16SrRNA的互补性的互补性SD的后续序列的核苷酸组成的后续序列的核苷酸组成SD与起始密码之间的距离与起始密码之间的距离mRNASD融合型表达载体：融合型表达载体：-融合蛋白融合蛋白非融合型表达载体：非融合型表达载体：-天然完整蛋白天然完整蛋白分泌型表达载体：分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周产物可跨膜分泌至胞周间隙间隙 原核表达载体的类型原核表达载体的类型融合型表达载体融合型表达载体 PSDForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因优点：优点：表达效率高表

49、达效率高产物稳定产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性 技术关键：技术关键：克隆基因插入原核序列克隆基因插入原核序列3端而维持正确阅读框架。端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点选择合适酶切位点加人工合成的加人工合成的DNA接头接头构建位相载体构建位相载体位相载体位相载体-含有含有3种读码框的系列载体种读码框的系列载体Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切割方便：pGEX-1 T凝血酶凝血酶 pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-X因子因

50、子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX系列系列非融合型表达载体非融合型表达载体 P PSDSDForeign DNAForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD：ATG：第一个密码子第一个密码子非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子启动子-温度诱导温度诱导插入位点插入位点-HpaI分泌型表达载体：分泌型表达载体：主要元件：主要元件：启动子和启动子和SD序列序列 信号肽序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜优点：分泌表达，避免降解。优点：分泌表达

51、，避免降解。分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII-ompA1没有真核转录后加工的功能，不能进行没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所的剪接，所以只能表达以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因；而不能表达真核的基因组基因；没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；性；表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵

52、体表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体（inclusion body），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总），尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使可能有是蛋白质合成速度太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性步纯化

53、，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性（renaturation），使其重新散开、重新折叠成具有天然），使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。蛋白，但表达量往往不高。原核表达系统的缺点原核表达系统的缺点具转录后加工系统具转录后加工系统具翻译后修饰系统具翻译后修饰系统可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达基因治疗基因治疗真核表达系统的必要性及优势真核表达系统的必要性及优势真核基因

54、结构及表达调控特点真核基因结构及表达调控特点真核基因组的复杂性：真核基因组的复杂性：真核基因组庞大，具大量非编码序列真核基因组庞大，具大量非编码序列-mRNA丰度丰度不同不同结构复杂：染色质、核膜、线粒体结构复杂：染色质、核膜、线粒体-表达调控多样表达调控多样不连续性：内含子、外显子不连续性：内含子、外显子没有操纵子结构没有操纵子结构 据受体细胞及表达载体的不同分为据受体细胞及表达载体的不同分为3种：种：酵母表达系统酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统 要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核

55、系统优越。真核表达载体至少要含两然应比原核系统优越。真核表达载体至少要含两类序列：类序列：原核质粒的序列原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的，包括在大肠杆菌中起作用的复复制起始序列制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基抗药性基因标志因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNADNA克隆、克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括包括启动子、增强子

56、、转录终止和加启动子、增强子、转录终止和加poly-Apoly-A信号信号序列、序列、mRNAmRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。别位点等。真核表达载体真核表达载体真核表达元件：真核表达元件：启动子启动子/增强子增强子克隆位点克隆位点终止信号和加终止信号和加poly(A)poly(A)信号信号剪接识别信号剪接识别信号复制与选择元复制与选择元件件外源基因的表达：外源基因的表达：胞内表达

57、胞内表达分泌表达：在分泌表达：在MCSMCS前加入信号肽序列前加入信号肽序列缺点缺点:不能实现全部的翻译后修饰功能不能实现全部的翻译后修饰功能ExampleIPTG-T7 RNA pol-His6-cDNACalreticulin as an example(Calreticulin is an ER chaperone)钙网蛋白 calreticulin 内质网中的一种需Ca2+的凝集素样分子伴侣蛋白(inhibits T7 pol)Inducibility in E.coli:via T7 RNA polymerasean inducibleOFFON+IPTGLac repressorL

58、ysozymeTo squelch background low level of T7 polcalreticulinLac repressorLac repressor gene(competes with his)Purification of the cloned gene product(Nitriloacetic acid chelate,NTA)MBP=maltose binding proteinGST=glutathione-S-transferaseAssorted protein tags used for purification(binds to biotin site)(Gets biotinylated in vivo)(Amp-resistance)(IgG-binding domain from Protein A)Enterokinase:Asp Asp Asp Asp Lys ORTag removal after purificationORTEV protease(tobacco etch virus):Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser 目的蛋白的分离纯化目的蛋白的分离纯化亲和柱亲和柱分子筛分子筛离子交换离子交换疏水层析疏水层析抗原抗体抗原抗体