Transwell侵袭实验

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1、Transwell侵袭实验1.实验前一天将ECM胶（8-12 mg/ml）（Sigma）放于4冰箱中融化过夜2.实验时将所用的枪头在冰上预冷半个小时，ECM胶用预冷的无血清1640按1：9稀释（稀释至1mg/ml），每孔中加入稀释好的ECM胶40l，放入37培养箱中，孵育5h3.水化基底膜：吸出小室中残余液体，每孔加入70ul含无血清1640培养液，37，30min，吸去培养基4.对数生长期的细胞，胰酶消化细胞，0.1%血清1640悬浮，计数，稀释至密度为1106/ml，每空中加200l细胞悬液5.24孔板下室一般加入600l含30%新生牛血清的1640培养基6.24h后，弃去孔中培液，PBS

2、洗2遍，甲醇固定20分钟，0.1%结晶紫染色15-20 min，用清水洗3遍以上，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞7.400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数个人觉得做Transwell就像小马过河一样，要讲究个体化，不同的细胞侵袭能力不同，胶的稀释倍数、细胞上样量、上下室血清浓度差以及孵育时间也不同。对于你的问题，我觉的不管是在温箱中放5个小时或者是在超静工作台中风干，其主要目的是为了让Matrigel从液体状变成胶冻状，在温箱中放置5个小时后，拿出来上室中肯定会有液体残留，此时一定要将残留的液体洗干净，然后在水化一下基底膜。(1) 吸去培养液，用棉签轻轻擦除上室聚碳酸酯膜内侧面贴壁细胞，用0

3、.01MPBS漂洗两次，4%多聚甲醛固定10 分钟；(2) 吸去固定液，将膜风干，每孔加0.6ml 0.1%结晶紫染液，室温中放置20 分钟；(3) 轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将上室取出，从聚碳酸酯膜内侧面用吸水纸吸干水分，自然干燥；(4) 测定前，将各实验组上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6ml 33醋酸脱色，充分振荡，每组设定5 复孔；同时设置调零孔（33醋酸）；比色：每孔取脱色液150l 加入96 孔板中，在570nm 处测定OD 值。2步骤21 Transwell小室制备211 无基质胶Transwell小室制备 包被基底膜（冰浴操作）：用50mg/LMatrigel 1:

4、8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面。24孔板每空50-70uL:20uL Matrigel + 160uL DMEM/F-124风干，过夜。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿

5、为最好)，置37 30min使Matrigel聚合成凝胶。212 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300l预温的无血清培养基，室温下静置1530min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。22 制备细胞悬液 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿1224h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗12遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至110105，个人认为不要超过5105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量

6、过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。23 接种细胞 取细胞悬液100200l加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200l。 24孔板下室一般加入500l含FBS或趋化因子的

7、培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 培养细胞：常规培养1248h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就开始出现了。所

8、以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的

9、形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后12h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。 24 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：241 直接计数法2411 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。通过给细胞染色，可在镜下计数细胞 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝

10、染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。个人推荐采用0.1%结晶紫染色，这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞，直接染色即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所在。因为，虽然经过准确的细胞计数，往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制，可能某一批实验穿过的细胞会特别多，以致细胞成堆，这种情况下就难以计数了，这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意，染色前要将膜风干，否则可能会染不上。 细胞计数：我们使用的是Leica DC 3

11、00F正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用35个视野，也有人用10个，都是随机选取，个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性，也会掺进人为影响，特别是计数视野较少的时候。我选取16个视野，不是随机选择，而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4。不同厂家不同型号的小室，膜的面积不尽相

12、同，但个人认为，拍照时还是应当选取固定的位置，并选择尽可能多的视野。2412 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。这种情况我没有遇到过，根据论坛里提供的经验，可以收集下层培养液，用流式细胞仪计数细胞量，也可用细胞计数的方法直接在镜下计数，个人认为MTT应该也是可以用的，有兴趣的可以试试看。 241 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。2411 MTT法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 24孔板中加入500l含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37 4h后取出。 24孔板中加入500l DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲臜充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。2411 荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。Chemicon的ECM554即属于这类。2411 结晶紫检测上文已说过，这里不再赘述，原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。