乙交酯_丙交酯共聚物的体内外降解行为及生物相容性研究

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1、乙交酯/ 丙交酯共聚物的体内外降解行为及生物相容性研究晴1 ,贝建中1 ,王身国1 ,王常勇2 ,范明2 , (1 . 中国科学院化学研究所分子科学中心 ,北京(2 . 军事医学科学院根底医学科学研究所 ,北京刘爽2 ,赵100080)100850)强2蔡摘 要 : 通过开环共聚方法合成了具有不同组成的乙交酯和 L - 丙交酯的共聚物 ( PL GA) ,进行了聚合物在37 、p H7 . 4 条件下的体外降解行为以及在大鼠体内的降解 。通过粘度测定 、失重 、1H - NM R 、DSC 、X - ray 衍射等手段详细研究了 PL GA 共聚物的体内外降解行为 ,并对降解机理进行了探讨 。

2、通过测定组织反响观 察研究了聚合物的生物相容性 。结果证明 : PL GA 共聚物是一类具有良好生物相容性的生物可降解性高分 子 ,通过改变组成可以有效调节共聚物的降解速度 ,是一类潜在的组织工程细胞支架材料 。关键词 : 聚 (乙交酯/ 丙交酯) ;体内降解 ;体外降解 ;生物相容性 ;组织工程中图分类号 : O63文献标识码 : A文章编号 : 1008 - 9357 (2000) 03 - 0249 - 06脂肪族聚酯是一类重要的生物降解高分子材料 ,它们在有水存在的环境或在体液中 ,能通过化学降解 即简单的酯键水解或酶促降解而断链 ,生成羟基脂肪酸 ,且在体内可参与三羧酸循环而进一步分

3、解 为 CO2 和 H2 O ,通过新陈代谢途径排出体外 ,因而被广泛深入地研究 。其中尤其是聚乙交酯 ( P GA) 、聚 丙交酯 ( PL A) 、聚己内酯 ( PCL ) 以及它们的共聚物 ,由于它们具有平安可靠 、良好的生物相容性和可控 的生物降解性能等多种特性 ,因此已在药物控制释放和手术吻合修复方面显示了重要和广阔的应用前景1 ,2。随着组织工程学的兴起 ,用生物降解性材料作为细胞支架材料的研究已受到科研人员的广泛关注 ,在国外已有应用于临床的报道3。目前 ,被研究用于作为细胞支架的合成高分子材料主要还是 PL AP GA ,以及它们两者的共聚物 ( PL GA) 。通过改变共聚物

4、的组成 ,可以调节材料的降解寿命从数周以至 数年 。近年来 ,虽然国际国内在用 PL GA 作为组织工程细胞支架材料的研究方面取得了较大进展 ,但 对 PL GA 共聚物的生物相容性和在体内降解吸收方面的研究报道还不多见 。本文在详细研究 PL GA 共聚物体外降解行为的根底上 ,进一步比拟了两种不同组成比例的 PL GA 共聚物在体内的降解行为特 征和生物相容性 ,为进一步应用 PL GA 作为组织工程的细胞支架材料提供参考 。1 试验局部1 . 1材料制备PL GA 共聚物的合成 :参考文献4,将一定比例的乙交酯和丙交酯装入经过硅烷化处理的聚合管 ,参加催化剂异辛酸亚锡的氯仿溶液 ,用氩气

5、除氧 、脱氯仿后真空封管 ,在 180 反响 1820 h 。将所得 的聚合产物溶于氯仿 ,配成约 10 wt %的溶液 ,过滤后于搅拌条件下缓慢滴加到乙醇中再沉淀 ,以去除未反响的单体和催化剂 ,最后在室温减压条件下枯燥至恒重 。共聚物采用 PL GA ( a/ b) 的形式表示 , 其中 a 和 b 分别代表丙交酯和乙交酯在投料中的摩尔百分数 。 收稿日期 :2000 - 05 - 09基金工程 : 国家重点根底研究开展规划 ( 973) 资助工程 ( G1999054305 和 G1999054306) 作者简介 : 蔡 晴 ( 1971 - ) ,女 ,湖北武汉市人 ,硕士 。 通讯联

6、系人 : 王身国 ( 1942 - ) , 男 , 上 海 市 人 , 研 究 员 , 博 士 , 博 士 生 导 师 , 研 究 方 向 : 高 分 子 科 学 及 生 物 医 用 材 料 , E - mail :wangsg hot mail . co m.共聚物膜的制备 :将一定量的共聚物配成 810 wt %的二氯甲烷溶液 ,采用溶液铸膜法 ,将上述溶液浇铸到聚四氟乙烯模具中 ,待溶剂挥发后 ,再在真空枯燥箱内室温枯燥 48 h 。1 . 2水解试验将按前法制得的样品膜 (厚约 0 . 30 . 5 mm) ,裁成小块 ,使其重量在 0 . 250 . 35 g 范围内 ,准确称 重

7、( W 0 ) ,然后将样品膜浸泡在 p H 7 . 4 、37 1 的磷酸盐缓冲溶液中 ,经过不同的时间间隔后取样 。磷 酸盐缓冲介质每周更新一次 。1 . 3体内埋植试验将矩形 PL GA 样条 (10 mm 4 mm 2 mm) 用 60 Co 照射灭菌处理后 ,在无菌条件下植入健康成年 大鼠的脊柱两侧肌内 ,每侧各两个试样 ,相距 3 cm ,然后在手术后的 2 、4 、8 和 12 周分别取出试样 。试 验用的健康成年大鼠雌雄各半 ,体重约 180200 g 。1 . 4表征方法粘度 : 以乌式粘度计测定共聚物在 30 下的特性粘数 ,并按公式 t / 0 100 %计算特性粘 数变

8、化率 。失重 :将枯燥至恒重的降解膜准确称重后 ,按式 ( W 0 -W t ) / W 0 100 %计算失重百分率 。式中W 0 和 W t 分别为降解处理前后试样的重量 。分子量和分子量分布 :采用 Waters 510 凝胶渗透色谱仪 ,以氯仿为淋洗剂 ,流速为 1 . 0 mL / min ,在 35 下测定后 ,以聚苯乙烯为标样计算共聚物的重均和数均分子量 。共聚物组成 :用 Varian 200 兆超导核磁共振谱仪 ,以 D - CHCl3 为溶剂 、TM S 为内标 ,在测定 1H- N M R 后计算 。热性能 :采用 Du Po nt 2100 型热分析仪 ,在升温速度为

9、10 / min ,温度范围 0250 下测定 。采用 Rigaku Dmax - 3B X - ray 衍射仪 ,Cu K 靶 ,结晶性 := 0 . 154 nm ,石墨单色器 。生物相容性 :将从大鼠体内植入试样周围取出的软组织标本用 10 %福尔马林固定 24 h 后 ,经石蜡包埋 , H - E 染色后进行组织学观察 。2 结果与讨论2 . 1PL GA 共聚物的体外降解行为研究了 PL GA (70/ 30) 和 PL GA (50/ 50) 在 p H 7 . 4 、37 1 条件下的降解行为 。从外观上可见 :随 着降解的进行聚合物变脆 、碎裂 ,且重量减少 。试样的特性粘数和

10、重量变化趋势如图 1 和图 2 所示 ,由图说明 : 随着降解的进行 ,共聚物的分子链发生断裂 ,共聚物的分子量逐渐减小 ,且有局部小分子量的降解产物从共聚物基体中扩散 、溶解到降解介质中 。以上结果说明了 PL GA 共聚物的可降解性 ,且是在降解初期分子量下降很快 。此外 ,还可观察到 ,随着共聚物中乙交酯组分从 30 %增加到 50 % ,共聚物的失重速度加快 。这是因为 P GA 是一个相对亲 水的组分 ,随 GA 含量的增加 ,共聚物的亲水性增加 ,而由于脂肪族聚酯在此条件下的降解仅发生水解断链 ,故表现为降解速度加快 。比拟图 1 和图 2 ,可以发现 :所检测到的共聚物开始明显失

11、重的时间远晚于共聚物的分子量开始急 剧下降的时间 ,这说明 PL GA 共聚物的降解是同时发生在整个聚合物基体中的 ,即属于本体降解的范 围5。表 1 列出了 PL GA (70/ 30) 和 PL GA (50/ 50) 在降解过程中共聚物组成的变化情况 。从表中可以看 出 ,随着降解的进行 ,共聚物中的乙交酯含量不断减少 、丙交酯含量相应不断增加 。这同样是因为 P GA 是一个相对较亲水的组分 ,所以高分子链段优先从 GA - GA 或 GA - L A 相接的酯键处断链 ,从而造成 乙交酯成分以较快的速度丧失 。Fig. 1 Change of inherent visco sit y

12、 of PL GA wit h degradatio n under p H 7 . 4 at 37 Fig. 2 Change of weight lo ss of PL GA wit h degrada2tio n under p H 7 . 4 at 37 共聚物在不同降解时间的 GPC 测试结果见图 3 。可以很清楚的看到 ,随着降解的进行 ,共聚物的分子量和分子量分布都发生了十清楚显的变化 ,即 PL GA 共聚物的分子量都逐渐减小 、分子量分布逐 渐变宽 ,且都不同程度的出现了双峰 ;尤其是在降解的后期 ,出现了一个分布窄的尖峰 ,而在较高分子量的位置还有一个小峰 。我们认为这是由

13、于随着降解的进行 ,共聚物中的乙交酯组分不断减少 ,使 PLL A链段从不能结晶到形成不完善结晶所引起的 ,因而聚合物的降解速度也变得缓慢 。Fig. 3 Change of GPC spect ra of PL GA wit h t he degradatio n under p H 7 . 4 at 37 , where“Ddenotes“dayand“wdenotes“week:lef t - PL GA ( 50/ 50) ; right - PL GA ( 70/ 30)Table 1 The co mpositio n change of PL GA (50/ 50) and PL

14、 GA (70/ 30) wit h degradatio n in p H 7 . 4 PBS at 37 1 为了证实上述假设 ,我们采用 DSC 和 X - ray 衍射两种手段对 PL GA ( 70/ 30) 的降解产物进行了分析 。如图 4 所示 ,原始的 PL GA (70/ 30) 试样是一个无定型聚合物 ,降解前只有一个 T g ,随着降解的进 行 ,共聚物逐渐出现两个 T m ,且 T g 也逐渐升高 ;随着降解程度的进一步深入 ,两个熔融峰逐渐靠近 ,以致最终只剩下一个示 。T m ,且熔融热 ( T m ) 不断增大 。 T g 、T m 和 T m 数据随降解过程的变

15、化如表 2 所Degradatio n time( week)lact yl / glycot ylDegradatio n time lact yl / glycot yl ( week) PL GA ( 50/ 50) PL GA ( 70/ 30)PL GA ( 50/ 50) PL GA ( 70/ 30)0 46 . 2/ 53 . 8 66 . 2/ 33 . 81 47 . 3/ 52 . 7 66 . 7/ 33 . 33 56 . 5/ 43 . 5 71 . 9/ 28 . 16 73 . 9/ 26 . 1 81 . 7/ 18 . 312 / 84 . 5/ 15 .

16、520 / 86 . 2/ 13 . 8Table 2 Change of T m and Hm of PL GA (70/ 30) wit h degradatio n under p H 7 . 4 PBS at 37 1 Hm T mDegradatio n timeT gT m1T m2 ( week) ( ) ( ) ( ) (J / g) ( ) 03461545 . 646 . 051 . 254 . 853 . 1/102 . 6108 . 8115 . 1109 . 7/119 . 0123 . 4121 . 7/23 . 835 . 041 . 649 . 3/16 . 4

17、14 . 66 . 6/ 20 54 . 3 116 . 0 / 54 . 4 / Fig. 4 Changes of DSC spect ra of PL GA ( 70/ 30) wit h degradatio n i n vi t ro , where “w denotes“week.Fig. 5Changes of X - ray diff ractio nspect ra of PL GA ( 70/ 30 ) wit hdegradatio ni n v i t ro ,where“wdenotes“week.同时 ,从 X - ray 衍射图谱 (图 5) 也可以看到 ,原始的

18、 PL GA (70/ 30) 试样膜并没有出现结晶衍射峰 ,说明其为无定型聚合物 ,和 DSC 的结果相一致 ;但随着降解时间的延长 ,逐渐出现由于结晶衍射而产生 的谱峰 。根据 PLL A 均聚物的衍射角数据 ( 2= 16 . 6 、19 . 2)6,可以判定由降解形成的结晶为 PLL A 链段结晶所致 。然而 ,出现在 1617的衍射峰并非是一个单峰 ,而是与 PLL A 均聚物不同的谱峰 ,且 它的裂分随着降解的进行不断减小 。这个现象和前述的 T m 、 Hm 的变化规律有着相同的规律 ,因此 可以证明上述的假设 ,即随着乙交酯成分的逐渐减少 ,L - 丙交酯开始形成结晶 ,并随着

19、乙交酯的进一 步减少 ,其结晶程度不断完善 ,因而结晶衍射峰逐渐靠近 、 T m 减小和 Hm 逐渐增大 。Fig. 6 Change of GPC spect ra of PL GA copolymers wit h t he degradatio n i n v i vo , where “w denotes “week and “M denotes“mo nt h: lef t - PL GA ( 50/ 50) ; right - PL GA ( 70/ 30)2 . 2PL GA 共聚物的体内降解行为对于 PL GA 共聚物在大鼠体内的降解行为 ,我们主要是用 GPC 测定了降解过程

20、中的共聚物的分子 量和分子量分布变化 ,并对 PL GA 试样的重量变化进行了测定 。试验结果说明 : PL GA 共聚物在体内降解时的失重速率 ( 表 3) 和在体外降解时 ( 图 2) 相近 ; 且它们 的分子量和分子量分布的变化趋势也十分接近 ,如图 3 和图 6 所示 。由此说明 PL GA 共聚物的降解受体内的酶促作用较小 。Table 3 The weight loss of PL GA copolymer wit h degradatio n time i n v i vo2 . 3 PL GA 共聚物的生物相容性研究中 ,采用组织反响观察方法对 PL GA 共聚物的生物相容性进

21、行了评价 。由组织反响观察 ( 图7) ,发现在试样植入大鼠体内 2 周后 ,在两种 PL GA 试样周围的肌肉组织都产生了少量的点状淤血 ,试 样周围有纤维状物 ,但纤维包囊尚未形成 ;进一步观察发现 ,植入物和组织界面有炎症细胞浸润 ,并可见少量多核巨细胞 ;纤维母细胞增生并分泌胶原纤维 ,开始形成疏松的纤维膜 ,但与周围肌肉分界不清 ;植入物附近肌肉组织轻度水肿 ,有散在出血点 ,局部肌纤维染色变浅 、肿胀 。植入 4 周后 ,在植入物周围均 可见包裹有一薄层半透明纤维包囊 ,而炎细胞开始减少 ,巨噬细胞和多核巨细胞那么相对增多 ,排列在材 料和组织界面上 ,纤维膜开始增厚 ,与肌肉分界

22、清楚 ,无微小脓肿形成 。到 8 周时 ,显微镜观察中性粒细胞和淋巴细胞相继减少 ,细胞膜稍致密 ,发现植入物周围肌肉已恢复正常 。至 PL GA 试样已埋入体内12 周时 ,发现纤维膜已逐渐稳定 ,仅存少量中性粒细胞及淋巴细胞 ,但还可见巨噬细胞 。Fig. 7 Photo s of o bservatio n of tissue reactivit y of PL GA ( 50/ 50) ( upper) and PL GA ( 70/ 30) (low2er) wit h degradatio n i n v i vo : (a) 2 weeks ( b) 8 weeks (c) 12

23、 weeks从两种 PL GA 试样的肌肉植入试验结果分析 ,在植入的三个月内 ,局部肌肉组织的中性粒细胞 、淋巴细胞等炎细胞浸润很少或者没有 ,说明这两种 PL GA 共聚物均具有良好的生物相容性和无异物反 应 。在术后的 8 - 12 周时 ,局部巨噬细胞和淋巴细胞浸润相对明显 ,但并无中性粒细胞出现 ,说明不是炎症反响 ,可能是由于 PL GA 共聚物的降解产物碎片的产生速度超过了体内组织的吞噬能力 ,而使局部形成酸性降解产物的堆积 ,造成 p H 值下降所致 。这一试验结果启示我们 ,需要进一步改善聚合物降 解时的微环境及聚合物的结构来调节聚合物的降解速度 。2 . 4PL GA 共聚

24、物的改性为消除脂肪族聚酯随降解过程产生酸性物质对生物相容性造成不利影响 ,我们将经过乙酰化处理 的甲壳质经再处理后以一定比例混入 PL GA (50/ 50) 的共聚物膜 ,然后再在 37 1 下进行水解试验Time( week)Weight lo ss ( %)Time Weight lo ss ( %) ( week) PL GA ( 50/ 50) PL GA ( 70/ 30)PL GA ( 50/ 50) PL GA ( 70/ 30)2 7 . 2 4 . 94 79 . 4 44 . 68 92 . 9 63 . 312 96 . 8 73 . 6测试了降解介质 (煮沸蒸馏水)

25、的 p H 值随时间的变化 (表 4) :发现甲壳质的参加可以有效地降低酸性降解产物对降解介质的 p H 值变化的影响 ,这是由于甲壳质的弱碱性可以中和 PL GA 降解产物所产生的 酸性的缘故 。鉴于甲壳质是具有优良生物相容性的天然高分子 ,因而与甲壳质共混是消除脂肪族聚交 酯降解产物酸性影响的有效途径 ,此法尚在进一步试验之中 。Table 4 Change of t he p H of medium wit h degradatio n of PL GA (50/ 50) under 37 1 wit h and wit hout chitosan.p HTime( week)Wit h

26、o ut of chito sanCo ntent of chito san 30 wt %Co ntent chito san 50 wt %02466 . 403 . 353 . 002 . 706 . 407 . 233 . 453 . 356 . 407 . 626 . 004 . 65结论3试验结果说明 : PL GA 共聚物是一类具有良好生物相容性的脂肪族聚酯 ,在体内和体外的降解行为十分相似 ,受体内的酶促作用较小 。通过调节共聚物的组成 ,可以使共聚物具有不同降解速度而满足不 同使用要求 。同时 , PL GA 共聚物在降解过程中产生的酸性产物对生物相容性造成的不利影响 ,也可

27、以 通过对共聚物的改性来消除 。因此 ,它将是一类潜在的组织工程细胞支架材料 。参考文献 :L D Richard. Clinical applicatio ns and up date o n t he poly (- hydro xy acids) in Bio medical applicatio ns of synt hetic bio degradable polymersM . J O Hollin ger eds , CRC Press Inc , Boca Rato n , 1995 . 17 - 31 .K A At hanasio u , G G Niederaner ,

28、C M Agrawal . Sterilizatio n , to xicit y , bioco mpatibilit y and clinical applicatio ns of polylactic acid/ polyg2lycolic acid copolymers J , Bio materials , 1996 , 17 : 93 - 102 .王身国. 可生物降解高分子的类型 、合成和应用J . 化学通报 ,1997 ,2 :45 - 48 .D K Gilding , A M Reed. Bio degradable polymers fo r use in surgery

29、 - polyglycolic/ polylactic acid ho mo - and copolymers J . Pol y2mer , 1979 , 20 : 1 459 - 1 464 .A K Richard , O L Maryann , T R Maho ney , et al . Poly (lactide - co - glycolide) deco mpo sitio n kinetics i n v i vo and i n v i t ro J . Macro molecules , 1987 , 20 : 2 398 - 2 403 .Suming Li , H G

30、arreau , M Vert . St ruct ure - p ropert y relatio nship s in t he case of t he degradatio n of massive poly ( - hydro xy acids) in aqueo us media , Part 2 , Degradatio n of lactide - glycolide copolymers : PL A 37 . 5 GA 25 and PL A 75 GA 25 J . J Mater Sci Mater , inMed , 1990 , 1 : 131 - 139 .123

31、456Study on the Biocompatibil ity and Degra dation Behavior ofPolyl( l - lactide - co - glycol ide) i n vi t ro and i n vi voCA I Qing , B EI J ian2zho ng , WAN G Shen2guo( Center fo r Molecular Sciences , Instit ute of Chemist ry , Chinese Academy of Sciences , Beijing , 100080 ,China) WAN G Chang2

32、yo ng , FAN Ming , L IU Shuang , ZHAO Qiang( Instit ute of Basic Medical Science , Academy of Military Medical Science , Beijing , 100850 ,China)Abstract : Poly ( l - lactide - co - glycolide) ( PL GA) copolymers were obtained by ring - opening copolymerizatio n of l - lac2 tide and glycolide using

33、Sn (Oct) 2 as catalyst . The degradatio n behavior of PL GA i n v i t ro and i n v i vo was st udied. The degra2 datio n of t he PL GA was mo nitored by measuring t he changes of viscosity , weight loss , co mpositio n , crystallinit y ect . . Tissue reactivit y was performed to evaluate t he bioco

34、mpatibilit y of t he PL GA copolymers. It p roved t hat PL GA copolymer was of good bioco mpatibilit y and t he degradatio n rate could be adjusted by changing t he co mpositio ns of t he copolymer . Furt hermore , t he degradatio n behavior of PL GA showed lit tle difference bet ween i n v i t ro a

35、nd i n v i vo , which implied t hat t he degradatio n of PL2GA was hardly affected by t he enzyme existing i n v i vo . It is suggested t hat PL GA copolymer is a potential material for using as cell scaffold in tissue engineering.Key words : poly ( l - lactide - co - glycolide) ; biodegradatio n ; i n v i t ro ; i n v i vo ; bioco mpatibilit y , tissue engineering