《生化实验讲义》word版

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1、食品生物化学实验指导书食品科学与工程学院实验一 糖的颜色反应及还原性检验A. 莫氏试验一、目的掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。二、原理糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与-萘酚生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。三、实验器材棉花或滤纸；吸管1.0ml（5）、2ml（1）；试管1.5cm15cm（5）；容量瓶50ml（5）；烧杯50ml（5）；棕色瓶50ml（5）；玻璃棒多根、电炉（配石棉网）多个。四、实验试剂莫氏试剂：称取-萘酚2.5g，溶于95乙醇并稀释至50ml。此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。1蔗糖溶液：称取蔗糖

2、0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。1葡萄糖溶液：称取葡萄糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。1果糖溶液：称取果糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。1淀粉溶液：将0.5g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至50ml。五、操作于5支试管中，分别加入1葡萄糖溶液、1蔗糖溶液、1果糖溶液与1淀粉溶液1 mL和少许纤维素（棉花或滤纸少量浸在1ml水中），然后各加莫氏试剂23滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。注意：一些非糖物质（如糠醛、

3、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。B. 塞氏试验一、目的掌握塞氏（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。二、原理酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。三、实验器材1 吸管0.5ml（3）、5.0ml（1）。2 试管1.5cm15cm（3）3 水浴锅。四、实验试剂1 塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100ml盐酸中VH2O：V(H

4、Cl)=2：1，临用时配制。2 1蔗糖溶液：同试验A。3 1葡萄糖溶液：同试验A。4 1果糖溶液：同试验A。五、操作于3支试管中分别加入1葡萄糖溶液、1蔗糖溶液、1果糖溶液各0.5ml，各加塞氏试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴中，比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。六、问答题1、分别写出两个实验的实验结果并进行分析。1葡萄糖溶液1蔗糖溶液1果糖溶液1淀粉溶液纤维素莫氏试剂浓硫酸塞氏试剂C糖的还原性检验一、目的和要求了解鉴定还原糖的方法及其原理。二、原理在碱性溶液中，具有自由醛基或酮基糖能将金属离子（铜、铋、汞、银等）还原，糖本身被氧化成酸类化合物。斐林试剂和班乃德试剂均为含Cu的碱性溶液,

5、还原糖被还原成红色或黄色的Cu2O。此法常用作还原糖的定性或定量测定。三、材料与仪器吸管1ml（5），2ml（1）；试管1.515cm；水浴锅四、试剂斐林试剂（液）：称取15g硫酸铜(CuSO45H2O)及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000ml。斐林试剂（液）：碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。班乃德试剂：取无水硫酸铜1.74g溶于100ml热水中，冷却后稀释至150ml；取柠檬酸钠173g，无水Na2CO3 100g和600ml水共热，溶解后冷却并加水至850ml，然后将

6、150mlCuSO4溶液倒入混合即成。此试剂可长期使用。淀粉溶液 %蔗糖溶液%葡萄糖溶液五、操作1、于支试管中各加入斐林试剂和液ml,混匀,分别加入%葡萄糖、%蔗糖和%淀粉溶液ml，置沸水浴中加热数分钟,冷却,观察各试管的变化.2、另取支试管,分别加入%葡萄糖、%蔗糖和%淀粉溶液ml,然后每管加入班乃德试剂ml,置沸水浴中加热数分钟,取出冷却,和上面结果比较.六.思考题斐林反应与班乃德反应都发生了什么化学变化?实验二 卵磷脂的提取和鉴定一、目的和要求掌握卵磷脂的提取方法及其鉴定方法。二、原理卵磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多。卵磷脂易溶于乙醇、乙醚等脂溶剂，可利用此溶剂提取。新

7、提取的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂肪酸被氧化而成黄褐色，卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，具有特殊的鱼腥味，可鉴别。三、试剂和器材（一）试剂1.鸡蛋卵黄2.95%乙醇3.10%NaOH溶液（二）器材1.烧杯 2.漏斗3.蒸发皿 4.水浴锅 5.试管 6.量筒四、操作步骤1.提取：于小烧杯内置蛋黄2g，加入热95%乙醇15mL，边加边搅，冷却，过滤，如滤液混浊，需重滤直到完全透明。将滤液置蒸发皿内，蒸气浴上蒸干，残留物即卵磷脂。2.鉴定：取提取的卵磷脂少许，置试管内加 10%NaOH溶液2mL，水浴加热，是否产生鱼腥味。另取一些卵磷脂溶于1mL乙醇中，添加12mL丙酮

8、，观察变化。五、思考题1.卵磷脂的主要生理功能有哪些?2.工业用大豆卵磷脂是如何制备的?3. 卵磷脂在食品工业的应用有哪些?实验三 蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的1、了解蛋白质和某些氨基酸的特殊颜色反应及其原理2、掌握几种常用鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验内容 对蛋白质及氨基酸的双缩脲反应、茚三酮反应、黄色反应、乙醛酸反应、偶氮反应、醋酸铅反应等颜色及沉淀反应进行定性确定。三、实验操作（一） 双缩脲反应1、实验原理当尿素加热到180左右时，两个分子的尿素缩合可放出一个分子氨后形成双缩脲，双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的红色配合物，此呈色反应称为双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有多

9、个肽键，其结构与双缩脲相似，故能呈此反应，而形成紫红色或蓝紫色的配合物。此反应常用作蛋白质的定性或定量的测定。2、试剂(1)尿素(2)10%NaOH溶液(3)1%CuSO4溶液(4)蛋白质溶液：将鸡蛋清用蒸馏水稀释1020倍，3层纱布过滤，滤液冷藏备用。3、操作（1）取少许结晶尿素放在干燥试管，微火加热，则尿素开始熔化，并形成双缩脲，释放的氨可用湿润的红色石蕊试纸鉴定。待熔融的尿素开始硬化，试管内有白色固体出现，停止加热，让试管缓慢冷却。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO4 23滴，混匀后观察颜色的变化。（2）另取一试管，加蛋白质溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1%

10、 CuSO4 23滴，振荡后将出现的紫红色与双缩脲反应所产生的颜色相对比。（二） 茚三酮反应1、实验原理除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮作用生成黄色物质外，所有-氨基酸与茚三酮发生反应生成紫红色物质，最终形成蓝紫色化合物。11500000浓度的氨基酸水溶液即能发生反应而显色。反应的适宜pH为57。此反应目前广泛地应用于氨基酸定量测定。2、试剂蛋白质溶液 （同前）；0.5% 甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液3、操作取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各1 ml，再各加0.5 ml 0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴加热23分钟，观察颜色变化。（三） 蛋白黄色反应1、实验原理蛋白质分子中含有苯环结构的

11、氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这类蛋白质可被浓硝酸硝化生成黄色的硝基苯的衍生物。该物质在酸性环境中呈黄色，在碱性环境中转变为橙黄色的硝醌酸钠。绝大多数蛋白质都含有芳香族氨基酸，因此都有黄色反应。皮肤、毛发、指甲等遇浓HNO3变黄即发生此类黄色反应结果。2、试剂(1)蛋白质溶液（同前）；(2)头发；(3)指甲屑；(4)0.5%苯酚溶液；(5)0.3%酪氨酸溶液；(6)10%NaOH溶液；(7)浓硝酸（=1.42克/毫升）3、操作取5支试管编号后分别按下表-1所示加入试剂，观察各管出现的现象，若有反应慢者可放置微火（或水浴中）加热，待各管均先后出现黄色后，于室温逐滴加入10%NaOH溶液直

12、至碱性，观察颜色变化。表1 试验编号管 号12345材料加入蛋白质溶液（4滴）指甲屑（少许）头发（少许）苯酚（4滴）酪氨酸（4滴）浓硝酸2滴2 ml2 ml4滴2滴现 象注意：向蛋白质溶液中加浓硝酸时，所出现的白色沉淀是强酸使蛋白质发生变性所致。（四） 乙醛酸反应1、实验原理含有吲哚基的色氨酸在浓硫酸存在下与乙醛酸（CHOCOOH）缩合，形成与靛蓝相似的物质。此反应机理尚不清楚，可能是由一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合而成的。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。2、试剂(1)蛋白质溶液（同前）。(2)0.03%色氨酸溶液。(3)冰醋酸（一般含有乙醛酸杂质，故可用冰醋酸代替乙醛酸）。(4)浓硫酸（分

13、析纯）。3、操作：取2支试管，分别加入蛋白质溶液及色氨酸各2滴，再加浓冰醋酸约12毫升，混匀，倾斜试管慢慢地沿管各加浓硫酸1毫升，使之两相重叠，静置5分钟后则两相界面处出现紫红色环，若效果不明显可在水浴加热。（五） 偶氮反应 1、实验原理偶氮化合物与酚核或咪唑环结合产生有色物质，酪氨酸和组氨酸与之反应则应产物分别为橙红色和樱红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。应当指出，组胺、酪胺、肾上腺素和胆色素分子也能发生此反应而显色。2、试剂：(1)蛋白质溶液（同前）；(2)0.3%组氨酸溶液；(3)0.3%酪氨酸溶液；(4)20%NaOH溶液；(5)重氮试剂溶液A：5克亚硝酸钠溶于1000毫升水

14、中。溶液B：溶解5克-氨基苯磺酸于1000毫升水中，溶解后再加入5毫升浓硫酸。A、B液分别存在密闭瓶中，用时以等体积混合。3、操作：取3支试管分别加入0.3%组氨酸、酪氨酸、蛋白质溶液，各45滴，再分别加重氮试剂A、B各10滴，振摇，混匀，取后向3支试管分别加入20%NaOH溶液23滴，观察各试管中有色物质的生成，若水浴加热效果更明显。（六）、醋酸铅反应1、实验原理多数蛋白质分子中常有含硫的氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱作用下可分解产生硫化钠。硫化钠与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀，若加入浓盐酸则有硫化氢气体产生。2、试剂(1)未稀释的鸡蛋清。(2)10%的NaOH溶液(3)1.

15、5%Pb(Ac)2溶液（醋酸铅溶液）(4)浓盐酸(5)醋酸铅试纸(将滤纸条浸入醋酸铅溶液中，湿透后取出，100烘干即可)3、操作：向试管中先加入1.5% Pb(Ac)2溶液约1毫升，再慢慢滴加10%的NaOH溶液，边加边振摇，直到产生的沉淀溶解为止。此时再向试管内加蛋白质溶液56滴，混匀。置酒精灯上加热1分钟，溶液变黑，小心加入浓盐酸约2毫升，黑色褪去，嗅其味，将湿润醋酸铅试纸置于管口，观察其颜色的变化。实验四 蛋白质的沉淀反应一、目的1熟悉蛋白质的沉淀反应。2进一步掌握蛋白质的有关性质。二、原理多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。三、实验器材1

16、试管1.5cm15cm（7）。2吸管5.0ml(2)、2.0ml(2)、1.0ml(1)。3吸滤瓶500ml(1)。4布氏漏斗。四、实验试剂1蛋白质试液：见实验二十三卵清蛋白液。2硫酸铵晶体：如果晶体太大，最好研碎。3饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml加硫酸铵至饱和。495%乙醇。5结晶氯化钠。61%醋酸铅：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。75%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100ml。81%硫酸铜溶液：见实验二十三。9饱和苦味酸溶液。101%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。五、操作A、蛋白质盐析作用向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析

17、。操作方法：1取蛋白质溶液5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。2将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。注意（1）应该先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液。（2）固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。B、乙醇沉淀蛋白质乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体的水化层而使其沉淀析出。操作方法取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。C、重金属盐析沉

18、淀蛋白质蛋白质与重金属离子（如Cu2+、Ag+、Hg2+等）结合成不溶性盐类而沉淀。操作方法取试管2支各加蛋白质溶液2ml，一管内滴加1%醋酸铅溶液，另一管内加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。D、生物碱试剂沉淀蛋白质植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。操作方法取试管2支各加2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液45滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管内加苦味酸溶液数滴，观察结果。实验五 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

19、质一、实验目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法 二、实验原理 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极

20、移动。 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。 肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时1、2、球蛋白升高，-球蛋白降低。肝硬化时2、-球蛋白降低，而1、-球蛋白升高。 三、实验器材 1、醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120m）2、人血清； 3、烧杯及培养皿 数只； 4、点样器； 5、竹镊子； 6、玻璃棒； 7、电吹风； 8、试管 六只； 9、恒温水浴锅； 10、电泳槽； 1

21、1、直流稳压电泳仪； 12、7220型分光光度计； 13、剪刀 四、实验试剂 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6)：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠12.76g和巴比妥1.66g溶解于500ml蒸馏水中,混匀； 2、染色液：氨基黑10B 0.5g、甲醇（A.R.）、冰乙酸（A.R.）10ml、加蒸馏水40ml，混匀即可，可反复使用； 3、漂洗液：取乙醇45ml，冰醋酸5ml，加蒸馏水50ml，混匀； 4、浸出液：0.4mol/L NaOH溶液； 5、透明液：取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml，混匀。 五、实验操作 1、准备和点样 取一条醋酸纤维薄膜，浸入缓冲液中，完全浸透后，用镊子轻轻取出，

22、将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液； 用玻棒蘸取少量血清，涂在点样器上，然后轻轻于距纤维薄膜一端1.5cm处接触，样品即呈一条状突于纤维膜上。待血清透入膜内，将薄膜平贴于已放在电泳槽上、并已浸透缓冲液的纱布上，点样端为阴极； 2、电泳 接通电源，设定电泳电压为100V，通电50分钟； 3、染色.完毕，将薄膜浸于染色液中510分钟，取出，用漂洗液漂至背景无色（约45次），再浸于蒸馏水中。.实验六 酵母RNA的提取与鉴定一、目的掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法二、原理酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使

23、其沉淀，由此即可得到粗RNA制品。用碱液提取的RNA有不同程度的降解。三、实验器材1、干酵母粉（市售）。2、鲜酵母（市售）。3、pH试纸（pH114）。4、电子天平。5、烧杯100mL(1)。6、量筒50mL（1）、10mL(1)。7、抽滤瓶500mL(1)。8、布氏漏斗10cm(1)。9、吸管0.50mL（1）、1.0mL(2)、2.0mL(2)、5.0mL(1)。10、离心机4000r/min。四、实验试剂1、0.2氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000mL。2、乙酸（A .R） 3、95乙醇4、无水乙醚（A. R）5、氨水（A. R）6、10硫酸溶液：浓硫酸（比重1.84）

24、10mL，缓缓倾于水中，稀释至100mL。7、5硝酸银溶液：5g AgNO3溶于蒸馏水并稀释至100mL,存于棕色瓶中.8、苔黑酚-三氯化铁试剂:将100mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中,再加入100mg FeCl36H2O，临用时配制。五、操作1、RNA的提取称取8g干酵母粉于100mL烧杯中, 加入0.2%NaOH溶液40mL,沸水浴加热30min, 经常搅拌. 冷却,加入乙酸数滴,使提取液呈酸性(pH56,用石蕊试纸试之), 离心1015min(4000r/min). 取上清液, 加入2倍体积的95%乙醇, 边加边搅. 加毕, 静置, 待完全沉淀, 过滤. 滤渣先用95%乙醇洗2次(每次

25、约10mL), 继而用无水乙醚洗2次(每次10mL),洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。 乙醚滤干后, 滤渣即为粗RNA, 可作鉴定和测定含量用。2、鉴定取上述RNA约0.5g, 加10%硫酸液5mL, 于三角瓶中,沸水浴上加热水解20min左右， 将RNA水解.(1) 取水解液0.5 mL, 加苔黑酚-三氯化铁试剂1mL, 加热至沸1min, 观察颜色变化.(2) 水解液2 mL, 加氨水2 mL及5%硝酸银溶液1 mL, 观察是否产生絮状的嘌呤银化合物.(3) 磷的鉴定 取水解液2ml，加入5滴浓硝酸和1ml 钼酸铵溶液，沸水浴加热23min，可见黄色的磷钼铵沉淀生成。实验七 POD活性的测

26、定一、原理过氧化物酶（POD）催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2将愈创木酚氧化，生成茶褐色产物。此产物在波长470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶的活性。二、实验材料、仪器和试剂1、实验材料马铃薯块茎、苹果2、仪器721型分光光度计（配10mm比色皿4个）；离心机（配10ml离心管）；瓷研钵（配研钵棒）；移液枪0.2ml1支、1ml两支；移液管（1ml 1支）；50ml烧杯一个3、试剂及其他（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH

27、值7.0） （2）0.05mol/L愈创木酚溶液（3）2H2O2溶液 （4）PVP（聚乙烯吡咯烷酮）（5）纸巾适量 （6）滤纸或称量纸适量（7）碎冰适量三、实验步骤（1） 酶液的制备：取1.00g洗净去皮的马铃薯块茎或去皮苹果，切碎，放入研钵中，加4ml磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，以13000r/min的转速离心15min，去除沉淀，上清液低温下保存备用。（2） 过氧化物酶活性的测定：测定酶活性的反应体系包括0.1ml酶液、1ml0.05mol/L愈创木酚溶液和2.0ml2H2O2溶液，以空气调零。反应体系加入酶液后，立即用721型分光光度计在波长470nm处测反应体系3m

28、in内吸光度，每隔30秒读数一次。（3） 步骤（2）重复三次。四、结果计算以每分钟A470nm变化0.01为1个过氧化物酶活力单位，计算马铃薯过氧化物酶的活力及比活力。式中：A为反应时间内吸光值的变化；W为马铃薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数。五、思考题（1） 记录实验结果并计算，分析结果。0s30 s60 s90 s120 s150 s180 sPOD1A470nmPOD2A470nm（2） 若有活性已知的辣根过氧化物酶，设计一个实验，以辣根过氧化物酶为标准绘制标准曲线，测定某植物中过氧化物酶的活力。（3） 酶活力的单位可用g（鲜重）、

29、g（干重）及mg（蛋白）3种方式来表示，哪种表示好些？为什么？实验八 发酵过程中的中间产物的鉴定一、实验目的1.学习在无氧条件下，葡萄糖的氧化作用。2.掌握检测代谢中间物存在的方法。二、实验原理在酵母菌中，葡萄糖经一系列反应首先产生丙酮酸。丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下转变为乙醛，后者接受NADH2中的2H而还原为乙醇，即生醇发酵。在正常情况下，代谢中间物丙酮酸、乙醛存在的量是不多的，为了证明它们作为反应途径的中间代谢物存在着，可向反应体系中加入一些酶的抑制剂，在研究的条件下，抑制催化某一化合物转变的酶。或者改变生理条件，使酶的活性降低；或者加入一种“诱获剂”，使它与中间代谢物反应后形成一种不能

30、进一步代谢的物质等。在弱碱条件下，丙酮酸脱羧酸活性丧失。因此丙酮酸不能进一步代谢而累积下来，它的存在可以通过与硝普酸钠或2，4-二硝基苯肼反应来证明。向反应混合物中加入亚硫酸钠，它可以“诱捕”乙醛，加入硝普酸钠或哌啶后，蓝色物质的形成说明有乙醛的存在。三、试剂1）0.5mol/L的磷酸氢二钠 7）5%的硝普酸钠（使用前制备）2）磷酸二氢钾溶液（0.5mol/L） 8）浓氨水3）酵母悬浮液：把1g鲜酵母块溶于 9）硫酸铵10ml磷酸氢二钠中（4冰箱保存） 10）亚硫酸钠4）酵母悬浮液：把1g鲜酵母块溶于 11）10%的氢氧化钠10ml磷酸二氢钾溶液中（4冰箱保存） 12）2，4-二硝基苯肼盐酸饱

31、和溶液（以5）酵母悬浮液：把1g鲜酵母块溶于10ml 2mol/L的盐酸配制）水中（4冰箱保存） 13）三氯乙酸（5%）6）10%的葡萄糖（4冰箱保存）四、实验器材1）37水浴 4）离心机2）吸量管（5ml、2ml、1ml、0.5ml） 5）试管及试管架3）离心管五、实验操作1.酵母菌的发酵作用1) 取2支干净试管，编号为1和2。注意，试管口应平整。把二支试管放于冰浴中冷却。2) 向每支试管中加入3ml预冷的葡萄糖溶液。3) 向试管1加入3ml以磷酸氢二钠制备的酵母悬浮液，迅速混合后于试管口上放一个载玻片。4) 向试管2中加入3ml以磷酸二氢钾配制的酵母悬浮液，迅速混合后于试管口上放一个载玻片

32、。5) 把两支试管放于37水浴中精确保温1h，然后向每管中加入2ml三氯乙酸，充分混合后，在3000r/min下离心10min。6) 吸出上清液，监测丙酮酸的生成2. 丙酮酸的检测1)硝普酸钠试验（1）取一支干净试管，加入大约1g硫酸铵，然后加入2ml煮沸过的上清液。（2）向试管中加入25滴新鲜配制的硝普酸钠溶液，充分混合，沿管壁慢慢加入浓氨水使形成两层。（3）如果有丙酮酸存在，在两液面交界处将产生绿色的或蓝色的环。由于巯基的存在，蓝色的或绿色的环出现之前，往往有桃红色的环出现，但存在的时间很短。2）2，4-二硝基苯肼实验取一支试管，加入2ml上清液，然后再加入1ml饱和的2，4-二硝基苯肼，

33、充分混合。另取一支试管，加入25滴上述混合液，再加入1ml氢氧化钠溶液，然后加水到大约5ml，如果有丙酮酸存在，将出现红色。3. 中间产物乙醛的鉴定1) 取三支干净试管，编号为，1、2和3。把三支管放入冰浴中冷却。2) 向管1中加入3ml水，向管2和管3中分别加入3ml葡萄糖溶液，然后再加入以水配制的酵母悬浮液3ml。3) 向管2中加入0.5g亚硫酸钠，充分混合。4) 把三支试管放于37水浴中保温1h。5) 将试管内容物在3000r/min下离心10min，取各管上清液检测乙醛的存在。6) 另取三支干净的试管，编号后分别加入管1、管2和管3的上清液2ml，再分别加入0.5ml新鲜配制的硝普酸钠及2ml哌啶，混合，若有乙醛存在，将有蓝色化合物产生。.思考题：1. 试管为什么要放于冰浴中冷却？2.硝普酸钠试验为什么要加硫酸铵？3.试验过程中要注意哪些事项？16