细菌DNA提取方法综述

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1、细菌 DNA 提取方法综述姓名：刘燕学号：1430170088班级:周二班摘要： 高效稳定的细菌基因组 DNA 提取方法对后续分子生物学的研究有着 重要的意义。不同的方法提取的 DNA 产量和纯度等方面有差异，会对后续步 骤产生很大影响。本文综述了目前广泛使用的 DNA 提取方法。关键词：细菌、基因组DNA、提取方法现代分子生物学技术如 DNA 重组技术（又称基因工程）、分子克隆技术、 PCR 技术等，为进一步认识生命活动的本质，更好地利用其规律为人类服务提 供了重要手段（马尧等，2005）。但是，DNA分离是成功利用这些技术的第一步， 也是非常重要的一步，可以说 DNA 质量的好坏直接决定了

2、后续实验的成败。 1基因组DNA提取方法不同，对细菌DNA降解程度的影响也不同，因此，从 细菌中提取基因组 DNA 的潜在困难较大。 目前国内外很多学者都在积极探索 并研究各种高效的细菌基因组DNA提取方法，本文就近10年来国内外有关细 菌基因组DNA的提取方法进行综述。21 DNA 细菌提取方法综合国内外文献，大致将细菌基因组DNA取提方法分为3大类：机械法、化 学法和酶法。机械法包括冻融法、超声波法和玻璃珠法等; 化学法包括加入 SDS 和苯酚等; 酶法包括加入裂解酶、蛋白酶 K 和溶解酶等。 31.1 机械法液氮冷冻研磨破碎细胞壁的方法通常用于植物总基因组 DNA 的提取破碎细胞 的物理

3、方法。对于不同的样品，需要根据具体的实际情况对超声条件进行优化。 超声波法常与其他方法结合使用，如与复合螯合剂（ 脱氧胆酸钠 +PEG +Chelex 100） 等结合使用。微珠振荡法也是常被研究者们采用的一种 DNA 提取方法。 赵文怡等10比较不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁时，发现玻璃微珠法可以 有效破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁， 所提取的基因组 DNA 可以作为模板用于 PCR 试验。31.2 化学法化学法主要是指通过添加化学试剂使细胞裂解从而释放出DNA，所用化学 药品主要有 SDS 和苯酚等。1）DNA-SDS）传统抽提法（酚氯仿法）：先用（十二烷基硫酸钠）溶解破坏 细胞膜蛋白和细胞

4、内蛋白，并沉淀蛋白质；然后用蛋白酶K水解消化蛋白质， 特别是与DNA结合的组蛋白，使DNA得以释放；再用有机溶剂去除蛋白质 和其他细胞组分；最后用乙醇沉淀核酸。2）加热煮沸法：通过加热煮沸使菌体破裂、蛋白热变性沉淀并释放 DNA。3）Chelex-100抽提法：离子螯合剂Chelex-100悬液在100C碱性环境（pH10-ll） 条件下，导致细胞膜破裂， DNA 变性和释放， 同时能通过结合金属离子，防止 所提取的DNA降解。4）改良DNA抽提方法：即几种提取方法的结合或条件的优化，有改进溶菌酶 法、SDS-NaOH 法、SDS-酶裂解法、SDS-CTAB 法 SDS-PVP 法和 Chel

5、ex-100 煮沸法 等。5）试剂盒抽提法：利用新型硅基材料 Hi-bind 的可逆结合特点，联合迷你柱旋转 分离技术，将细菌 DNA 结 合 到 柱 上 ， 再 用 无 菌 去 离 子 水 洗 脱 DNA。 主要有离心柱法、真空泵法等，也有报道采用自动化操作提取细菌基因 组 DNA.91.3 酶法目前广泛使用的酶法是溶菌酶法。溶菌酶能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和 N-乙酰胞壁酸之间的伕1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，从而细菌细胞在 内部渗透压的作用下胀裂而死亡。赵文怡等比较了不同方法破除金黄色葡萄球菌 细胞壁的结果， 发现溶菌酶法用时最长， 且效率最低。而刘敏等通过比较几种 不同的细菌 DN

6、A 提取方法提取金黄色葡萄球菌 DNA 得出结论， 溶菌酶能有 效地降解金黄色葡萄球菌细胞壁，且用溶菌酶破壁后提取的 DNA 适于 PCR 试 验。 32 几种细菌 DNA 提取方法的优劣 传统提取方法（酚-氯仿抽提法）及改良方法虽然效率较高，但费时费力，操作 中需要多次离心，步骤繁琐，增加了样品污染的可能性，且提取过程中易造成DNA损失。加入酚类物质或SDS会严重干扰后续PCR反应，且所用试剂有一 定毒性，大量使用有害健康，易造成环境污染，不适合常规使用。加热煮沸法操作简单、提取时间短，但加热过程中菌体破裂比例极少，且煮沸过 程中部分 DNA 降解，致使 DNA 提取效率很低。 同时因革兰氏

7、阳性细菌的细 胞壁较厚，加热不能使其破裂，故无法提取基因组 DNA ，这是该方法的另一 大缺陷。Chelex-100 煮沸法被认为是目前抽提革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌基因组DNA 最为简便快捷的方法 4，且成本较低，但其所提 DNA 纯度比酚 - 氯 仿抽提法低， 提取的 DNA 保存时间也有待验证，故该法只可用于短期研究。碱裂解法5是一种简便的细菌基因组DNA提取方法，但该法需使用强碱，对DNA 具有一定的腐蚀性。 在强碱性及一定温度条件下能迅速破碎细胞膜和核 膜，使核酸酶变性，并释放 DNA ，此时 DNA 的一级结构相对完整，此方法 在细菌质粒 DNA 提取中应用较多。SDS 裂解法及溶

8、菌酶法一般需要复杂的裂解液体系，并借助蛋白酶 K 和 RNA 酶获得高质量的抽提产物，且部分药品及相关酶试剂价格昂贵6。CTAB 抽提法常用于植物和部分革兰氏阴性菌中。试剂盒法提取的 DNA 效率和产量相对较高、质量稳定、易标准化，但试剂盒 价格昂贵，使用次数有限， 不适用于大量样本的基因组 DNA 提取。不同厂家 和生产批次的试剂盒也有差异， 分别偏重于细胞、病毒、细菌的基因组 DNA 提 取，对不同类型的样品效果也不相同。3 同一文献对不同方法提取效果和效率的比较夏涵等7 用加热煮沸法、酚 - 氯仿法、 Chelex-100 法及试剂盒法比较细菌 基因组 DNA 提取产量和 OD 260

9、/OD 280 值，发现试剂盒法提取效果最好， Chelex-100 和酚 - 氯仿抽提法效果次之，沸水浴法效果最差， 4 种方法除沸 水浴法均可扩增出 3 种细菌的目的基因片断，且效果较好，没有出现杂带和拖 带现象。姚红等8用酚 - 氯仿抽提法、 DNA 试剂盒抽提法、沸水浴法、溶菌酶裂解 法、 SDS 裂解法对同种细菌基因组 DNA 提取得率进行比较， 发现溶菌酶 - 盐析法提取效率最高，酚 - 氯仿抽提法提取效率次之， 碱裂解煮沸法和溶菌酶 煮沸法提取效率较低，加热煮沸法提取效率最低。4 细菌 DNA 提取的建议1 ）实验研究时根据不同细菌，选择和建立不同提取方法，获得高纯度、高质量 模

10、板 DNA ；2 ）提取过程中应多做几组平行样，以保证 DNA 提取得率及质量的准确性；3 ）用乙醇洗涤后无法看到 DNA 沉淀时，可加入醋酸铵，出现沉淀后再用乙 醇洗涤；4 ）在细菌基因组 DNA 提取过程中，某些物理、化学因素也会影响 DNA 的 提取效率或后续实验的准确性，因此在提取细菌 DNA 的过程中应将这些物质 净化处理， 尽量减小提取过程中引进的物质对后续实验研究的不利影响；5 ）提取的细菌基因组 DNA 用乙醇多次洗涤，去除杂质后再保存备用。5 结论与讨论比较文献后发现， 大部分文献都采用改良方法和试剂盒法提取 DNA ，以提高 DNA 得率，但相同方法在不同文献中得到的细菌基

11、因组 DNA 得率相差较大， 没有可比性。 综合比较各文献 DNA 提取得率和同一文献或实验室中使用不同 的提取方法可知，改良后的传统法提取得率较高,Chelex-100和试剂盒法次之， 加热煮沸法最低。目前，有效、快速、经济地提取高纯度、高质量的细菌基因组DNA，仍是分子 生物学研究的基本问题。 本文针对近几年国内外的各种 DNA 提取方法进行阐 述比较后发现：简化实验步骤，用非有机溶剂法代替传统的有机溶剂法以减少污 染，采用各种固体吸附剂有效去除 PCR 反应抑制剂以及降低成本，已成为提取 细菌基因组 DNA 的发展趋势。参考文献：1 熊明华,朱继荣,王光利,等.一种快速经济提取革兰氏阴性

12、和革兰氏阳性细菌基因组 DNA 的方法J.基因组学与应用生物学,2016年，第35卷，第2期，第385-390页.2 郝敏，刘占英,杨天舒，等细菌基因组DNA提取方法概述J.生物学通报，2014年，第49 卷, 第 3 期.3 高慧琴，刘凌.PCR-DGGE技术中不同DNA提取方法综述J.安徽农业科学，Journal of Anhui AgriSci2011， 39（ 1） :52， 102 .4 Cheng H. R., Jiang N. Extremely Rapid Extraction of DNAfrom Bacteria anYeasts.Biotechnol Lctt,2006,

13、28（1）:5559.5 周双清，黄小龙，黄东益等.Chelex-100快速提取放线菌DNA作为PCR扩增模板生物 技术通报,2010,(2):123125.6 余道军，童文娟，陈岳明等临床标本细菌基因组DNA提取方法探讨.中国微生态学杂 志，2007，19(6):519.7 夏涵,府伟灵，陈鸣快速提取细菌DNA方法的研究.现代预防医学,2005,32(5):571 573.8 姚虹，吕治,苏建荣.不同方法提取阴道加德纳菌细菌基因组DNA的比较.中国实验诊断 学， 2011，15(1):123125.9 Stormer M., Kleesiek K., Dreier J. High-volume extraction ofnucleic acids by magnetic bead technology forultrasensitivedetection of bacteria in blood component. Clin Chem, 2007,53(1):104105.10 赵文怡，高强，谯娜娜，等.玻璃微珠法提取葡萄球菌基因组DNA的研究J.现 代食品科技， 2010( 2) : 154 156