细菌DNA提取方法综述

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1、细菌 DNA 提取方法综述姓名:刘燕学号:1430170088班级:周二班摘要: 高效稳定的细菌基因组 DNA 提取方法对后续分子生物学的研究有着 重要的意义。不同的方法提取的 DNA 产量和纯度等方面有差异,会对后续步 骤产生很大影响。本文综述了目前广泛使用的 DNA 提取方法。关键词:细菌、基因组DNA、提取方法现代分子生物学技术如 DNA 重组技术(又称基因工程)、分子克隆技术、 PCR 技术等,为进一步认识生命活动的本质,更好地利用其规律为人类服务提 供了重要手段(马尧等,2005)。但是,DNA分离是成功利用这些技术的第一步, 也是非常重要的一步,可以说 DNA 质量的好坏直接决定了

2、后续实验的成败。 1基因组DNA提取方法不同,对细菌DNA降解程度的影响也不同,因此,从 细菌中提取基因组 DNA 的潜在困难较大。 目前国内外很多学者都在积极探索 并研究各种高效的细菌基因组DNA提取方法,本文就近10年来国内外有关细 菌基因组DNA的提取方法进行综述。21 DNA 细菌提取方法综合国内外文献,大致将细菌基因组DNA取提方法分为3大类:机械法、化 学法和酶法。机械法包括冻融法、超声波法和玻璃珠法等; 化学法包括加入 SDS 和苯酚等; 酶法包括加入裂解酶、蛋白酶 K 和溶解酶等。 31.1 机械法液氮冷冻研磨破碎细胞壁的方法通常用于植物总基因组 DNA 的提取破碎细胞 的物理

3、方法。对于不同的样品,需要根据具体的实际情况对超声条件进行优化。 超声波法常与其他方法结合使用,如与复合螯合剂( 脱氧胆酸钠 +PEG +Chelex 100) 等结合使用。微珠振荡法也是常被研究者们采用的一种 DNA 提取方法。 赵文怡等10比较不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁时,发现玻璃微珠法可以 有效破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁, 所提取的基因组 DNA 可以作为模板用于 PCR 试验。31.2 化学法化学法主要是指通过添加化学试剂使细胞裂解从而释放出DNA,所用化学 药品主要有 SDS 和苯酚等。1)DNA-SDS)传统抽提法(酚氯仿法):先用(十二烷基硫酸钠)溶解破坏 细胞膜蛋白和细胞

4、内蛋白,并沉淀蛋白质;然后用蛋白酶K水解消化蛋白质, 特别是与DNA结合的组蛋白,使DNA得以释放;再用有机溶剂去除蛋白质 和其他细胞组分;最后用乙醇沉淀核酸。2)加热煮沸法:通过加热煮沸使菌体破裂、蛋白热变性沉淀并释放 DNA。3)Chelex-100抽提法:离子螯合剂Chelex-100悬液在100C碱性环境(pH10-ll) 条件下,导致细胞膜破裂, DNA 变性和释放, 同时能通过结合金属离子,防止 所提取的DNA降解。4)改良DNA抽提方法:即几种提取方法的结合或条件的优化,有改进溶菌酶 法、SDS-NaOH 法、SDS-酶裂解法、SDS-CTAB 法 SDS-PVP 法和 Chel

5、ex-100 煮沸法 等。5)试剂盒抽提法:利用新型硅基材料 Hi-bind 的可逆结合特点,联合迷你柱旋转 分离技术,将细菌 DNA 结 合 到 柱 上 , 再 用 无 菌 去 离 子 水 洗 脱 DNA。 主要有离心柱法、真空泵法等,也有报道采用自动化操作提取细菌基因 组 DNA.91.3 酶法目前广泛使用的酶法是溶菌酶法。溶菌酶能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和 N-乙酰胞壁酸之间的伕1,4糖苷键,破坏肽聚糖支架,从而细菌细胞在 内部渗透压的作用下胀裂而死亡。赵文怡等比较了不同方法破除金黄色葡萄球菌 细胞壁的结果, 发现溶菌酶法用时最长, 且效率最低。而刘敏等通过比较几种 不同的细菌 DN

6、A 提取方法提取金黄色葡萄球菌 DNA 得出结论, 溶菌酶能有 效地降解金黄色葡萄球菌细胞壁,且用溶菌酶破壁后提取的 DNA 适于 PCR 试 验。 32 几种细菌 DNA 提取方法的优劣 传统提取方法(酚-氯仿抽提法)及改良方法虽然效率较高,但费时费力,操作 中需要多次离心,步骤繁琐,增加了样品污染的可能性,且提取过程中易造成DNA损失。加入酚类物质或SDS会严重干扰后续PCR反应,且所用试剂有一 定毒性,大量使用有害健康,易造成环境污染,不适合常规使用。加热煮沸法操作简单、提取时间短,但加热过程中菌体破裂比例极少,且煮沸过 程中部分 DNA 降解,致使 DNA 提取效率很低。 同时因革兰氏

7、阳性细菌的细 胞壁较厚,加热不能使其破裂,故无法提取基因组 DNA ,这是该方法的另一 大缺陷。Chelex-100 煮沸法被认为是目前抽提革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌基因组DNA 最为简便快捷的方法 4,且成本较低,但其所提 DNA 纯度比酚 - 氯 仿抽提法低, 提取的 DNA 保存时间也有待验证,故该法只可用于短期研究。碱裂解法5是一种简便的细菌基因组DNA提取方法,但该法需使用强碱,对DNA 具有一定的腐蚀性。 在强碱性及一定温度条件下能迅速破碎细胞膜和核 膜,使核酸酶变性,并释放 DNA ,此时 DNA 的一级结构相对完整,此方法 在细菌质粒 DNA 提取中应用较多。SDS 裂解法及溶

8、菌酶法一般需要复杂的裂解液体系,并借助蛋白酶 K 和 RNA 酶获得高质量的抽提产物,且部分药品及相关酶试剂价格昂贵6。CTAB 抽提法常用于植物和部分革兰氏阴性菌中。试剂盒法提取的 DNA 效率和产量相对较高、质量稳定、易标准化,但试剂盒 价格昂贵,使用次数有限, 不适用于大量样本的基因组 DNA 提取。不同厂家 和生产批次的试剂盒也有差异, 分别偏重于细胞、病毒、细菌的基因组 DNA 提 取,对不同类型的样品效果也不相同。3 同一文献对不同方法提取效果和效率的比较夏涵等7 用加热煮沸法、酚 - 氯仿法、 Chelex-100 法及试剂盒法比较细菌 基因组 DNA 提取产量和 OD 260

9、/OD 280 值,发现试剂盒法提取效果最好, Chelex-100 和酚 - 氯仿抽提法效果次之,沸水浴法效果最差, 4 种方法除沸 水浴法均可扩增出 3 种细菌的目的基因片断,且效果较好,没有出现杂带和拖 带现象。姚红等8用酚 - 氯仿抽提法、 DNA 试剂盒抽提法、沸水浴法、溶菌酶裂解 法、 SDS 裂解法对同种细菌基因组 DNA 提取得率进行比较, 发现溶菌酶 - 盐析法提取效率最高,酚 - 氯仿抽提法提取效率次之, 碱裂解煮沸法和溶菌酶 煮沸法提取效率较低,加热煮沸法提取效率最低。4 细菌 DNA 提取的建议1 )实验研究时根据不同细菌,选择和建立不同提取方法,获得高纯度、高质量 模

10、板 DNA ;2 )提取过程中应多做几组平行样,以保证 DNA 提取得率及质量的准确性;3 )用乙醇洗涤后无法看到 DNA 沉淀时,可加入醋酸铵,出现沉淀后再用乙 醇洗涤;4 )在细菌基因组 DNA 提取过程中,某些物理、化学因素也会影响 DNA 的 提取效率或后续实验的准确性,因此在提取细菌 DNA 的过程中应将这些物质 净化处理, 尽量减小提取过程中引进的物质对后续实验研究的不利影响;5 )提取的细菌基因组 DNA 用乙醇多次洗涤,去除杂质后再保存备用。5 结论与讨论比较文献后发现, 大部分文献都采用改良方法和试剂盒法提取 DNA ,以提高 DNA 得率,但相同方法在不同文献中得到的细菌基

11、因组 DNA 得率相差较大, 没有可比性。 综合比较各文献 DNA 提取得率和同一文献或实验室中使用不同 的提取方法可知,改良后的传统法提取得率较高,Chelex-100和试剂盒法次之, 加热煮沸法最低。目前,有效、快速、经济地提取高纯度、高质量的细菌基因组DNA,仍是分子 生物学研究的基本问题。 本文针对近几年国内外的各种 DNA 提取方法进行阐 述比较后发现:简化实验步骤,用非有机溶剂法代替传统的有机溶剂法以减少污 染,采用各种固体吸附剂有效去除 PCR 反应抑制剂以及降低成本,已成为提取 细菌基因组 DNA 的发展趋势。参考文献:1 熊明华,朱继荣,王光利,等.一种快速经济提取革兰氏阴性

12、和革兰氏阳性细菌基因组 DNA 的方法J.基因组学与应用生物学,2016年,第35卷,第2期,第385-390页.2 郝敏,刘占英,杨天舒,等细菌基因组DNA提取方法概述J.生物学通报,2014年,第49 卷, 第 3 期.3 高慧琴,刘凌.PCR-DGGE技术中不同DNA提取方法综述J.安徽农业科学,Journal of Anhui AgriSci2011, 39( 1) :52, 102 .4 Cheng H. R., Jiang N. Extremely Rapid Extraction of DNAfrom Bacteria anYeasts.Biotechnol Lctt,2006,

13、28(1):5559.5 周双清,黄小龙,黄东益等.Chelex-100快速提取放线菌DNA作为PCR扩增模板生物 技术通报,2010,(2):123125.6 余道军,童文娟,陈岳明等临床标本细菌基因组DNA提取方法探讨.中国微生态学杂 志,2007,19(6):519.7 夏涵,府伟灵,陈鸣快速提取细菌DNA方法的研究.现代预防医学,2005,32(5):571 573.8 姚虹,吕治,苏建荣.不同方法提取阴道加德纳菌细菌基因组DNA的比较.中国实验诊断 学, 2011,15(1):123125.9 Stormer M., Kleesiek K., Dreier J. High-volume extraction ofnucleic acids by magnetic bead technology forultrasensitivedetection of bacteria in blood component. Clin Chem, 2007,53(1):104105.10 赵文怡,高强,谯娜娜,等.玻璃微珠法提取葡萄球菌基因组DNA的研究J.现 代食品科技, 2010( 2) : 154 156

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