专题篇基因诊断与基因治疗

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1、基因变异致病类型基因变异致病类型内源基因的变异内源基因的变异基因结构突变基因结构突变基因表达异常基因表达异常外源基因的入侵外源基因的入侵第第 一一 节节基因诊断基因诊断Gene Diagnosis（二）、分类（二）、分类 DNA DNA诊断诊断以以DNADNA为检测对象的诊断方法。为检测对象的诊断方法。RNA RNA诊断诊断以以mRNAmRNA为检测对象的诊断方法。为检测对象的诊断方法。一、基因诊断的概念和特点一、基因诊断的概念和特点 （一）、定义（一）、定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否和方法，直接检测基因结构

2、及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。正常，从而对疾病作出诊断的方法。（三）、特点（三）、特点n针对性强针对性强 n特异性高特异性高n灵敏度高灵敏度高 n适用性强，诊断范围广适用性强，诊断范围广二、二、基因诊断常用技术方法基因诊断常用技术方法 （一）、核酸分子杂交技术（一）、核酸分子杂交技术（二）、聚合酶链反应（二）、聚合酶链反应（三）、基因测序（三）、基因测序（四）、基因芯片（四）、基因芯片（五）、（五）、DNADNA指纹指纹（一）、核酸分子杂交（一）、核酸分子杂交(molecular hybridization)技术技术 核酸分子杂交核酸分子杂交可用以检测可用以检测样本中是否存在

3、与探针序列互样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。补的同源核酸序列。核酸探针核酸探针 是一类具有放射是一类具有放射性标记或化学标记的并与目的性标记或化学标记的并与目的目的目的DNA或或RNA分子序列互补分子序列互补的寡核苷酸片段。的寡核苷酸片段。探针探针是能够同某种待研究的核是能够同某种待研究的核酸序列或蛋白多肽链特异结合的任酸序列或蛋白多肽链特异结合的任何分子，经标记之后可用来检测目何分子，经标记之后可用来检测目的的DNA/RNA 或蛋白质分子。或蛋白质分子。实验流程：实验流程：提取提取DNA(限制酶限制酶切切)凝胶电泳凝胶电泳膜转移膜转移杂交杂交放放射自显影射自显影分析分析建立在核酸

4、杂交技术基础上的常用基因诊断方法1、限制性内切酶、限制性内切酶(restriction endonuclease)酶谱分析法酶谱分析法2、DNA限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分分析法析法 3、等位基因特异寡核苷酸、等位基因特异寡核苷酸(allele specific oligonucleotide,ASO)探针杂交法探针杂交法1、限制性内切酶酶谱分析法、限制性内切酶酶谱分析法 是利用限制性内切酶和特异性是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异探针来检测是否存在基因变异的一种

5、方法。的一种方法。Mst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析AT 正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析2、DNA-RFLP分析法分析法 中性突变是指在人基因组中，平均每200对碱基可发生一对变异的现象。DNA多态性是指中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。限制性片段长度多态性是指DNA多态性若发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段。RFLP分析法分析法3、

6、ASO杂交法杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于正常和突变基因碱基序列的两种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交来检测是否存在等位基因突变。ASO杂交法杂交法探针：探针：M N M N M N M N 正常基因正常基因 纯合突变纯合突变 杂合突变杂合突变 基因缺陷基因缺陷 （新的突变类型？）（新的突变类型？）（二）、聚合酶链反应（二）、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是利用特异的引物，特异地扩是利用特异的引物，特异地扩增目的增目的DNA的方法。的方法。实验流程：实验流程：提取提取DNAPCR凝胶电泳凝胶电泳显色显色分析

7、分析5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 1 1、基本工作原理、基本工作原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。2、常用的常用的PCR方法方法：常规常规PCR、巢式、巢式PCR、多重、多重PCR、多种、多种PCR、不对称、不对称PCR、反、反转录转录PCR、定量反转录、定量反转录PCR、mRNA差异显示差异显示PCR、原位、原位PCR、实时实时PC

8、R等等。等等。3、在、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法技术基础上的常用基因诊断方法nPCR-SSCP法法*nPCR-ASO法法nPCR-RFLP法法nPCR-限制酶谱法限制酶谱法nPCR-STR（短串联重复序列，（短串联重复序列，short tandem repeat）SSCP是指相同长度的单链是指相同长度的单链DNA因其碱因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。单链构象多态性单链构象多态性(single stra

9、nd conformation polymorphism,SSCP)PCR-SSCP分析分析 是指是指PCR产物变性后，经聚丙产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。确定致病基因的存在。正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变Leber 遗传性神经病患者遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析分析 （线粒体（线粒体DNA第第11778位位GA所致）所致）+（三）、基因测序（三）、基因测序(gene sequencing)(gene sequencing)即测定某一基因的碱基序

10、列。即测定某一基因的碱基序列。实验流程：实验流程：提取提取DNA分离出有关基因分离出有关基因测序测序分析诊断分析诊断 基因测序的方法：基因测序的方法：n化学裂解法化学裂解法nDNA链末端合成终止法链末端合成终止法nDNA自动测序自动测序（四）、基因芯片（四）、基因芯片（gene chip)gene chip)基因芯片，又称基因芯片，又称DNA芯片、芯片、DNA阵阵列、寡核苷酸微芯片（列、寡核苷酸微芯片（DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip）是指将许多特定的寡核苷酸片段是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定或基因片

11、段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出定性和定作出比较和检测，从而迅速得出定性和定量的结果。量的结果。基因芯片的应用基因芯片的应用1、在诊断中的应用、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找核酸序列分析、基因表达分析、寻找新基因、突变基因和基因多态性检测等新基因、突变基因和基因多态性检

12、测等2、在药学研究中的应用、在药学研究中的应用 药物筛选、药物作用机制研究、耐药药物筛选、药物作用机制研究、耐药菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化学毒物的筛选、基因扫描等学毒物的筛选、基因扫描等（五）、（五）、DNA指纹指纹(DNA fingerprint)在人基因组在人基因组DNA中有高度可变的中有高度可变的“小卫星小卫星”区域，采用区域，采用“小卫星小卫星”基因探针，在同一限基因探针，在同一限制酶切产物的制酶切产物的DNA杂交杂交图谱上，同一个体图谱上，同一个体不同组织来源的不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而的谱带完全一致，而不同个体之间（同卵双生除外

13、）谱带都不相不同个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因此这种因此这种杂交杂交图谱被称为图谱被称为DNA指纹或遗传指纹或遗传指纹指纹（genetic fingerprint）。简言之：简言之：DNA指纹或遗传指纹指纹或遗传指纹是指是指采用采用“小卫星小卫星”基因探针基因探针进行进行DNA分子杂交分子杂交（Southern 印迹，印迹，Southern blotting）所得的图谱。所得的图谱。实验流程：实验流程：提取提取DNADNA限制酶切限制酶切凝胶电泳凝胶电泳膜转移膜转移杂交杂交放射自显放射自显影影分析分析三、基因

14、诊断的应用三、基因诊断的应用n遗传疾病遗传疾病n肿瘤肿瘤n感染性疾病感染性疾病n传染性流行病传染性流行病n判断个体疾病易感性判断个体疾病易感性n器官移植组织配型器官移植组织配型n法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定总结 基因诊断的概念、特点、常基因诊断的概念、特点、常用的技术方法及应用。用的技术方法及应用。复习题1、名词解释：、名词解释：基因诊断、基因诊断、DNA诊断、诊断、RNA诊断、诊断、RFLP分析、分析、SSCP、基因芯片、基因芯片、DNA指纹指纹2、简述基因诊断的特点、常用技术方、简述基因诊断的特点、常用技术方法及可用于诊断的疾病。简述基因变异法及可用于诊断的疾病。简

15、述基因变异致病的类型及内源性基因变异的类型。致病的类型及内源性基因变异的类型。简述限制性内切酶谱分析法、简述限制性内切酶谱分析法、ASO探针探针杂交法、杂交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、分析、基因芯片、DNA指纹等的实验流程。指纹等的实验流程。第第 二二 节节基因治疗基因治疗Gene Therapy（一）、基因治疗的概念（一）、基因治疗的概念早期早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前目前广义上来讲是指将某种遗传物质转广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用

16、，以移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。达到治疗疾病目的的方法。一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念（二）、基因治疗的基本方法（二）、基因治疗的基本方法1 1、基因矫正、基因矫正(gene correction)2 2、基因置换、基因置换(gene replacement)3 3、基因增补、基因增补(gene augmentation)4 4、基因失活、基因失活(gene inactivation)1、基因矫正、基因矫正(gene correction)指将致病基因的异常碱基进行纠指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。正，而正常部分予以保留。纳米钳纳米钳

17、A G C T G T G A A G T C G T GA G C T G T G A A G T C G T GT C G A C A C T T C A G C A CT C G A C A C T T C A G C A CabnormalgeneGene correctionnormalgeneTACG2 2、基因置换、基因置换(gene replacement)指用正常的基因通过体内基因同源指用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内的重组，原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。完全恢复正常状态。A G C T G T G A G C T G T G

18、 C C A A G T C G T GA A G T C G T GT C G A C A C T C G A C A C G G T T C A G C A CT T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G C A A G T C G T GA G C T G T G C A A G T C G T GT C G A C A C G T T C A G C A CT C G A C A C G T T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G A G C T G T G T T A A G T C G T GA A G T C G

19、T GT C G A C A C T C G A C A C A A T T C A G C A CT T C A G C A CabnormalgeneGene replacement3、基因增补、基因增补(gene augmentation)将目的基因导入病变细胞或其他细将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有基因表达增强。陷基因的功能或使原有基因表达增强。A G C T G T G A G C T G T G C C A A G T C G T

20、 GA A G T C G T GT C G A C A C T C G A C A C G G T T C A G C A CT T C A G C A CnormalgeneA G C T G T G A G C T G T G T T A A G T C G T GA A G T C G T GT C G A C A C T C G A C A C A A T T C A G C A CT T C A G C A CabnormalgeneGene augmentation4 4、基因失活、基因失活(gene inactivation)(gene inactivation)指将特定的序列

21、导入细胞后，在转录指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。已达到治疗疾病的目的。几种常见的基因失活技术几种常见的基因失活技术反义核酸技术反义核酸技术核酶技术核酶技术三链技术三链技术干扰干扰RNA技术技术肽核酸肽核酸基因敲除基因敲除反义反义(antisence)核酸技术核酸技术 是指用人工合成的是指用人工合成的RNA或或DNA来阻断基因的转录或复制，来阻断基因的转录或复制，使编码基因不能转录为使编码基因不能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质。因而不能翻译成相应的蛋白质。反义反义RNA技术技术 反义反义RNA

22、是指与是指与mRNA互补，互补，且能抑制与疾病发生直接相关基因表且能抑制与疾病发生直接相关基因表达的达的RNA。反义反义RNA技术技术是指利用反义是指利用反义RNA在在mRNA水平上封闭基因表达，水平上封闭基因表达，最终可通过调节剂量，来治疗由基因最终可通过调节剂量，来治疗由基因突变或过度表达所致的疾病或严重感突变或过度表达所致的疾病或严重感染性疾病。染性疾病。T C G A C A C T C G A C A C A A T T C A G C A CT T C A G C A CA G C T G T G A G C T G T G T T A A G T C G T GA A G T C

23、 G T GabnormalgeneGene inactivationabnormalmRNA U C G A C A C A U U C A G C A CU C G A C A C A U U C A G C A C反义反义RNARNA A G C U G U G A G C U G U G U U A A G U C G U G A A G U C G U GAbnormal proteinAbnormal protein核酶核酶(ribozyme)技术技术 通过核酶分子结合到靶通过核酶分子结合到靶RNA分分子中适当的部位，形成锤头核酶结子中适当的部位，形成锤头核酶结构，催化对靶构，催化

24、对靶RNA分子的剪切，从分子的剪切，从而破坏靶而破坏靶RNA分子达到治疗疾病的分子达到治疗疾病的目的。目的。5353靶靶RNA核酶分子核酶分子核酶技术核酶技术三链技术三链技术(triplex approach)又称为又称为反基因策略反基因策略(antigene stragegy)，是利用脱氧寡核苷酸能与双，是利用脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链螺旋双链DNA专一性序列结合，形成三专一性序列结合，形成三链链DNA，从而在转录水平或复制水平阻，从而在转录水平或复制水平阻止基因转录或复制的技术。止基因转录或复制的技术。能形成三链能形成三链DNA的脱氧寡核苷酸称的脱氧寡核苷酸称为三链为三链DNA形成脱氧寡核

25、苷酸（形成脱氧寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotide,TFO)。复制、转录复制、转录三链三链DNA技术技术干扰干扰RNA(interference RNA,RNAi)技术技术 RNAi是指在特定因子作用下，是指在特定因子作用下，有导入胞内的双链有导入胞内的双链RNA降解生成的降解生成的约约22nt左右的左右的SiRNAs(single strand RNAi)。RNAi技术技术是指利用碱基互补配是指利用碱基互补配对原则，使对原则，使RNAi和靶和靶DNA结合，结合，同时诱导激活体内的基因沉默因子，同时诱导激活体内的基因沉默因子，从而使靶从而使靶DNA降解。降解

26、。dsRNARNAi-DNARNA、DNA降解降解干扰干扰RNA技术技术RNAiRNAi技术的特点技术的特点n特异性强特异性强n效率性高效率性高n作用时间长作用时间长n可通过细胞屏障而发挥作用可通过细胞屏障而发挥作用肽核酸肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)技术技术 PNA是指是指DNA-肽复合物。肽复合物。PNA技术技术是利用多肽与是利用多肽与DNA的的特异性结合，专一地抑制某一基因的特异性结合，专一地抑制某一基因的表达。表达。肽肽肽核酸技术肽核酸技术基因敲除基因敲除(gene knock-out)技术技术 指有目的的去除动物体内某种指有目的的去除动物体内某种基因的技术

27、。基因的技术。（三）、基因治疗的其他方法（三）、基因治疗的其他方法1、“自杀基因自杀基因”的应用的应用 某些病毒或细菌的基因所表达的酶能某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细胞内转变为细胞毒性产物，从而导致携带胞内转变为细胞毒性产物，从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基因为自杀基因。因为自杀基因。自杀基因自杀基因 无毒、低毒的药物前体无毒、低毒的药物前体 细胞细胞毒性产物毒性产物细胞死亡细胞死亡2、基因疫苗的应用、基因疫苗的应用 将编码外源性抗原的基因插入到含将编码外源性抗原的基因

28、插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞接导入人或动物体内，让其在宿主细胞内表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应内表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。答。重组表达质粒重组表达质粒外源性抗外源性抗原基因原基因基因疫苗基因疫苗二、基因治疗的基本程序二、基因治疗的基本程序一、治疗性基因的选择一、治疗性基因的选择 目的基因的选择目的基因的选择二、基因载体的选择二、基因载体的选择三、靶细胞的选择三、靶细胞的选择四、基因转移四、基因转移五、外源基因表达的筛选五、外源基因表达的筛选 利用载体中的标记基因利用载体中的标记基因 有有neoneor

29、 r标记基因时，用标记基因时，用 418 418进行筛选进行筛选六、回输体内六、回输体内 静脉回输静脉回输 自体骨髓移植自体骨髓移植 埋入皮下组织埋入皮下组织病毒载体病毒载体*非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法(ex vivo)(ex vivo)直接体内疗法直接体内疗法(in vivo)(in vivo)常见基因载体的优缺点常见基因载体的优缺点载体载体 优点优点 缺点缺点逆转录病毒逆转录病毒 基因组小并且简单基因组小并且简单 仅感染分裂细胞仅感染分裂细胞 稳定整合于宿主基因组稳定整合于宿主基因组 随机整合可能导致突变随机整合可能导致突变 生物学特性清楚生物

30、学特性清楚 常常只有短暂表达常常只有短暂表达 可高效转入复制中的细胞可高效转入复制中的细胞 病毒滴度低病毒滴度低107pfu/ml107pfu/ml 对宿主无害对宿主无害 可能会于有复制能力的病毒重组可能会于有复制能力的病毒重组腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒 基因组小基因组小 未知未知 可特异整合于人染色体可特异整合于人染色体19q 19q 需腺病毒辅助复制需腺病毒辅助复制 以人细胞作为宿主以人细胞作为宿主 携带外源基因能力有限携带外源基因能力有限 无毒，无致病性无毒，无致病性 难得到高滴度病毒难得到高滴度病毒腺病毒腺病毒 适用于原位使用，尤其是肺适用于原位使用，尤其是肺 不与宿主基因整合不与宿

31、主基因整合 在不分裂细胞中可进行高效率在不分裂细胞中可进行高效率 只有短暂表达只有短暂表达 的体内感染的体内感染 无特异性靶细胞无特异性靶细胞 病毒滴度高病毒滴度高1010pfu/ml 1010pfu/ml 病毒蛋白可引起免疫反应和炎症反应病毒蛋白可引起免疫反应和炎症反应 生物学特性清楚生物学特性清楚 插入外源基因能力有限插入外源基因能力有限脂质体脂质体 无感染能力无感染能力 无特异性靶细胞无特异性靶细胞 理论上无理论上无DNADNA大小限制大小限制 转染效率低转染效率低 毒性低毒性低 仅有短暂表达，体内应用困难仅有短暂表达，体内应用困难受体介导的转运受体介导的转运 无感染能力无感染能力 转染

32、效率低转染效率低 特异性转染靶细胞特异性转染靶细胞 体内应用困难体内应用困难 理论上无理论上无DNADNA大小限制大小限制 可能有免疫原性可能有免疫原性 构建灵活构建灵活 只有短暂表达只有短暂表达载体载体 优点优点 缺点缺点 三、基因治疗的应用与展望三、基因治疗的应用与展望(一）、应用一）、应用遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病感染性疾病、神经系统疾病1、是单基因缺陷病、是单基因缺陷病2、是体细胞病、是体细胞病3、靶细胞易获取、培养、操作、回输、靶细胞易获取、培养、操作、回输4、治疗效果甚于危害、治疗效果甚于危害5、无需严格的表达水平调控、无需严格的表达水平调控6、动物实验证明符合严格的安全标准、动物实验证明符合严格的安全标准基因治疗研究的病种应该符合的条件基因治疗研究的病种应该符合的条件