肿瘤细胞DNA样品基于二次谐波发生的非线性光谱学成像

《肿瘤细胞DNA样品基于二次谐波发生的非线性光谱学成像》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肿瘤细胞DNA样品基于二次谐波发生的非线性光谱学成像（10页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、 .wd.肿瘤细胞DNA样品基于二次谐波发生SHG的非线性光谱学成像罗冬梅1，邓小元1，卓双木2，谭淑雯1，庄正飞1，金鹰1*1.华南师范大学生物光子学研究院，广州510631；2.福建师范大学医学光电科学与技术重点实验室，福州350007摘 要：二次谐波的产生是一个二阶非线性光学过程，这个过程只发生在中心对称系数不为零的非中心对称区域。利用二次谐波显微技术可以对各种具有内源性信号的生物组织进展无损伤实时成像，如结缔组织的胶原纤维或肌细胞的肌动球蛋白。在生物化学和构造生物学中，虽然DNA是由脱氧核糖核苷酸构成而蛋白质是由氨基酸残基组成，但是DNA和蛋白质大分子高级构造的形成机制是相似的。本文利

2、用光谱学成像技术对不同DNA样品进展检测，来获取DNA样品的SHG信号并进展高解析度成像。这些DNA样品包括基因组DNA溶液、细胞核提取物以及培养细胞的细胞核。实验结果说明在常规条件下可以获得基因组DNA溶液和细胞核提取物的SHG信号，但几乎观测不到来自培养细胞核区的SHG信号。通过在培养基中添加少量无水乙醇体积比小于5%，可以在培养细胞的细胞核区域检测到SHG信号。我们推测在培养细胞中乙醇和DNA相互作用引起DNA分子构象发生变化，这些变化可能导致了DNA分子非线性光学性质的改变。关键词：二次谐波发生；基因组DNA；细胞核提取物；培养肿瘤细胞；乙醇中图分类号：O 433; Q 523文献标识

3、码：ANonlinear spectral imaging of DNA specimens derived from tumor cells based on second harmonic generationLuo Dong-Mei1, Deng Xiao-Yuan1, Zhuo Shuang-Mu2, Tan Shu-wen1, Zhuang Zheng-Fei1, Jin Ying1*(1. College of Biophotonics of South China Normal University, Guangzhou 510631, China;2. Key Laborato

4、ry of Optoelectronic Science and Technology for Medicine of Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China)Abstract: Second harmonic generation (SHG) is a second-order nonlinear optical process that has symmetry constraints confining signal to regions lacking a center of symmetry. Using SHG microsco

5、py, a variety of tissue structures have noninvasively been imaged by virtue of intrinsic signal generated by structured proteins such as collagen fibrils in connective tissues or the actomyosin lattice of muscle cells. In biochemistry and structure biology, the high-level structures of DNA and prote

6、in macro-molecules are similar in constructing mechanism, although DNAs consist of deoxynucleotides and proteins of amino acid residues. The principal purpose of present work is to detect the SHG signal from different DNA samples by spectral imaging technology based on two-photon excited fluorescenc

7、e (TPEF) and SHG. These DNA samples include the solution of genomic DNA and extracted nuclei, and cultured living cells. Results show that we can obtain the SHG signal from solution of genomic DNA and extracted nuclei in routine condition, but nothing from cultured cell nuclei. After adding a little

8、 of absolute ethanol (less than 5% by volume) in culture medium, the SHG signal is detectable in the interest region of nuclei. The findings suggest that the interaction between ethanol and DNA in living cell gives rise to the shift of molecular conformation, and this shift change some nonlinear opt

9、ical properties of DNA molecules.Key words: Second harmonic generation; genomic DNA; extracted nuclei; cultured tumor cell; ethanol双光子激发荧光成像Two-photon excited fluorescence imaging，TPEF1是上世纪90年代开展起来的一种非线性显微成像技术，它是一种基于细胞或生物组织中荧光团对两个光子具有双倍于单光子激发波长的同时吸收然后再发射的成像过程。由于双光子激发只发生在焦点附近的极小区域，故无需共焦小孔confocal pin

10、hole即可实现三维高分辨成像，可降低在光学成像中的荧光漂白效应，减少光化学毒性。其成像可采用近红外的超快激光作为光源，组织吸收和散色效应小，具有成像深度深、对生物体损伤小、分辨率高等优点。虽然TPEF成像具有一系列优点，但它仍不能消除焦点内生物组织的光漂白和光损伤。近年来开展起来的二次谐波Second harmonic generation, SHG2成像技术抑制了这一缺点，它利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源，具有高分辨、高比照度的三维成像能力。在成像质量和光损方面有了显著提高，是一种理想的非侵入生物活体的成像方法。其成像过程中无能量吸收，对生物体无光损伤和光

11、致毒，且生物组织的许多内在构造无需外加分子探针即可产生较强的SHG信号，可消除染料致毒的影响。同时，二次谐波显微镜不受前向发射性质的限制，可以两个方向收集信号，因此很容易与双光子激发荧光显微镜TPEF、OCTOptical coherence tomography等联合使用，进展成像对比，实现信号互补。SHG和TPEF的激发强度与激发光的平方成正比，两种显微方法的空间分辨率相当，意味着能够从同一装置上得到这两种信号的对照模式，除了使用不同的滤光片外，二次谐波显微成像和双光子激发荧光显微成像在系统构造上完全兼容。近年来，二次谐波-双光子SHG-TPEF联合成像技术已经被广泛应用于生物组织和细胞的

12、研究3-5。 二次谐波技术很早就被应用于生物组织成像6。其后，在多种生物组织中都可检测到SHG信号，如角膜7 、鼠尾肌腱8和牛的I型Achilles腱、人的皮肤9等。此外，手性分子如核酸DNA或RNA、蛋白质、糖元、淀粉、纤维素、磷脂等都具有手性，而它们的单体如核苷酸、氨基酸等，也都是手性分子，手性分子具有非中心对称的构造，可以产生SHG信号，因此对核酸进展二次谐波显微成像成为可能。早期研究说明，在商品化的DNA样品10和经过固定处理的前列腺癌细胞样品11中检测到了DNA产生的SHG信号。本文以体外培养的肿瘤细胞为实验对象，应用光谱成像技术对新鲜提取的基因组DNA、细胞核提取物和培养状态的肿瘤

13、细胞进展光谱学成像，在此根基上讨论乙醇对DNA构象可能存在的潜在影响。1材料与方法1.1 实验装置实验装置使用多光子激光扫描共聚焦显微成像系统Fig.1。该系统由飞秒激光系统、扫描显微系统、探测系统三局部组成。飞秒激光系统由高能量的二极泵源固体激光器(VerdiV-10)作为激发光源、美国Coherent公司生产锁模钛宝石(Ti：Sapphire Laser，Mira-900F)作为激光工作物质和声光调制器(AOM)三局部组成。声光调制器AOM用来调节激光的功率，激光的偏振方向为水平偏振，光纤耦合。波长可调协范围为700nm980 nm，脉冲宽度约为110 fs，重复频率 76 MHz。扫描显

14、微系统是由德国Zeiss公司生产的LSM510 Axiovert 200倒置激光扫描共聚焦显微镜，实验所用探测系统配置的是META探测器。图1 多通道非线性光学实验装置原理图Figure1 Schematic of multimode nonlinear optical imaging system钛宝石飞秒激光器发出的超短脉冲激光通过声光调制器AOM后到达双光子激光扫描显微镜作为激发光，经过主二向色性光束分束器MDBS由油浸物镜63，N.A.=1.4聚焦到样品上，样品在基频光激发下产生背向二次谐波再经油浸物镜收集，经过红外光束滤色片IR Block：Zeiss KP650滤除漫反射的基频光后

15、将激发光输送到META探测器，由探测器探测后转变为电信号传输至计算机。实验探测系统配置了META探测器，它是由一个高质量的反射光栅和一个32通道的光电倍增管photomultiplier tube, PMT阵列组成。该系统有多通道成像模式和光谱成像模式两个成像模式，这两个成像模式均使用META探测器获取图像。其中多通道成像模式有八个独立的通道，通过设置相应的参数可检测样品382714nm波段的发射光信号并得到该波段的光学二次谐波-双光子二维图像；光谱成像模式可以记录相应波段的光学二次谐波-双光子荧光图像的光谱。本文结合这两种成像模式获取样品的多通道非线性二次谐波-双光子图像及其相应的光谱。1.

16、2 样品制备人肝癌细胞系BEL-7402中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，37快速复苏，洗涤后接种于含生长在含10%胎牛血清，100U/mL 的青霉素及链霉素的DMEM(Gilbco Invitrogen)完全培养液中，37、5%CO2培养箱中培养。根据细胞生长状况更换培养液或进展传代培养。传代培养时用0.25%胰蛋白酶含0.02%EDTA进展消化，经洗涤后，每培养瓶25ml的接种量约为1105个细胞。收集处于对数生长期的肿瘤细胞用于基因组DNA和细胞核的提取。用于SHG成像的培养肿瘤细胞提前一天接种于共焦显微镜专用培养皿NEST, GBD-35-15。根据操作手册，利用组织/细胞基因

17、组DNA快速提取试剂盒(Dongsheng, Guangzhou, China)提取肿瘤细胞的基因组DNA；利用组织/细胞细胞核快速提取试剂盒(Solarbio, Beijing, China) 提取肿瘤细胞的细胞核。1.3 SHG成像 实验前首先开启激光器和显微镜，激光器预热约两小时稳定工作后开场实验。分别将实验样品置于显微镜下进展观察，首先找到样品分散良好的视野，将荧光显微镜转到扫描的位置，然后不断缩小扫描范围，以获得完整清晰的图像，观察目标样品的细微构造。选择两个通道来采集和记录被检测样品的二次谐波-双光子荧光信号获得该样品的二次谐波-双光子荧光成像图像。系统自带工具调焦平台(HRZ 2

18、00 stage, Carl Zeiss)用来改变焦点的位置，得以在不同区域处成像。用ROI工具获取各个区域处二次谐波信号的光强分布，用Histo工具获得各个区域处二次谐波信号的平均光强。从382nm处(设定后保持不变)开场扫描，每增加10nm扫描一次直到没有信号，获得了不同波长处的二次谐波-双光子荧光成像，与此同时光谱成像模式记录相应的光谱。LSM 510 Image Examiner软件处理获得的图像，调整图像的比照度、亮度对图像进展进一步的处理以期获得较好的图像。2 结果2.1 基因组DNA溶液的发射光谱经紫外分光光度计测量，基因组DNA溶液的浓度为30g/ml，A260/A280=1.

19、90，符合实验要求。图2为实验中得到的肝癌细胞基因组DNA的二次谐波-双光子荧光发射光谱。实验中使用激发光波长为800nm、功率为10mW的飞秒激光对肝癌细胞DNA进展扫描，光谱信号变化范围为382714nm。从图中可以看出基因组DNA溶液在404nm和639nm处各有一个波峰，其中404nm处的波峰是来自于SHG的信号，639nm处的波峰是来自于TPEF的信号。该DNA样品的光谱学成像在整个扫描窗口中显示为均质的背景，说明DNA分子在溶液中均匀分布结果未显示。图2 基因组DNA溶液的二次谐波光谱Figure 2 SHG-TPEF Spectra of genomic DNA solution

20、2.2 细胞核提取物的成像与光谱 为了获得肝癌细胞核提取物的二次谐波信号，实验中对提取出来的肝癌细胞核进展了二次谐波-双光子成像扫描并作出了相应的发射光谱图。图3a和图3b是肝癌细胞核提取物双光子二次谐波成像，图3c是相应的发射光谱。其中图3b的扫描区域是图3a扫描区域的4.5倍，即放大了4.5倍。实验中激发光波长、激发功率及光谱信号变化范围同上(2.1)。从图3a和图3b中可以看出肝癌细胞核提取物具有很强的二次谐波信号，相应的光谱图也显示肝癌细胞核提取物的SHG-TPEF信噪对比高。 图3 细胞核提取物的二次谐波-双光子荧光成像a, b及其相应的发射光谱cFigure 3 SHG-TPEF

21、imaging of the extraction of the hepatocellular carcinoma cells (HCC) nuclei (a, b) and the corresponding emission spectra(c)2.3 培养细胞的SHG/TPEF成像在未改变任何实验条件的情况下，用同样的方法对培养状态下的肿瘤细胞的细胞核区域进展光谱扫描时，几乎无法获得可以识别的SHG信号。考虑到基因组DNA和细胞核提取过程中广泛使用有机溶剂可能是造成DNA分子光学特性改变的因素，因此尝试在实验中向细胞培养液中添加少量的无水乙醇，具体步骤是：在培养液中滴入4滴无水乙醇溶液体

22、积比5%，约3分钟后进展光谱扫描。图4a和图4b分别为不添加乙醇的肝癌细胞和添加了无水乙醇的肝癌细胞的二次谐波-双光子成像，图3(c)为对应的光谱图。从图(a)和图(b)中可以看出添加了乙醇的肝癌细胞的二次谐波-双光子成像明显强于未添加乙醇的肝癌细胞的二次谐波-双光子成像,相应的光谱显示未添加乙醇的样品无SHG信号，添加乙醇的样品在激发光的半波长404nm处有波峰，此为SHG信号。 图4肝癌细胞的二次谐波-双光子成像 (a)和添加乙醇的肝癌细胞的二次谐波-双光子成像(b)及其相应的发射光谱(c)Figure 4 SHG-TPEF images from the HCC (a) and the

23、HCC of adding ethanol (b), the corresponding emission spectra are shown in (c).The red box is the region of interest of nuclei of the cell, six regions of interest are detected in (a) and eight regions of interest are detected in (b), the corresponding spectra are separately made according to the av

24、erage of these regions of interest in (a) and (b)3 讨论二次谐波-双光子共聚焦显微技术是近年来开展起来的观察微观世界和生物细胞构造的有力工具。它最大的优点探测深度深，对生物体的损伤小，时间空间分辨率高以及对构造的对称性敏感等12-13。我们采用二次谐波-双光子共聚焦显微技术对三组DNA样品进展观察，实验结果显示在常规条件下即可观测到基因组DNA和细胞核提取物的SHG信号，但却未检测到培养细胞细胞核区的SHG信号，当在培养基中添加了少量无水乙醇后可观测到其SHG信号。由于DNA大分子具有非中心对称的手性构造12，且其反向平行的双螺旋构造造成的准相

25、位匹配Pseudo-phasematching使其能够产生二次谐波10，因此可被作为产生SHG的标本。早期的研究发现，在商品化的DNA样品10和经过固定处理的前列腺癌细胞样品11中检测到了DNA产生的SHG信号，其中Sheppard10等人利用SHG显微成像观察到了鲱鱼精DNA在蒸馏水中的SHG成像， 而庄正飞11等人则利用SHG-TPEF显微成像技术获得了前列腺组织细胞细胞核切片的SHG信号。本实验2.1和2.2的DNA样本均来自新鲜培养的肿瘤细胞，实验结果再次说明了基因组DNA和细胞核均可以产生较强的SHG信号。2.1的光谱图中在639nm处还有一个波峰，这是来自于卟啉及其衍生物的TPEF

26、信号14-15，细胞中的细胞色素、血红素等生物大分子均含有卟啉，卟啉可以与DNA结合并发生相互作用16-17，故可能是在DNA提取过程中细胞中的卟啉大分子与DNA结合很难被完全洗脱残留在DNA溶液中造成在639nm处有一个波峰。2.2的光谱图中SHG-TPEF信噪对比2.1高，由于在真核生物，DNA以非常致密的形式存在于细胞核内，能够以多种形态超螺旋和环形等构象存在于细胞核中，而基因组DNA是以线性双链存在于溶液中，其DNA致密程度远低于细胞核DNA，故基因组DNA的SHG-TPEF信噪对比细胞核提取物的SHG-TPEF信噪比低。理论研究说明，二次谐波的产生必须满足两个条件，一是介质必须具有非

27、中心对称构造(Non-centrosymmetric structures)，二是必须满足相位匹配Relaxed phase matching的条件3-4,18。2.1 和2.2 验证了DNA分子是能够满足发生的条件的，但从2.3 a可以看出在常规培养的肿瘤细胞的核区几乎无法检测到DNA的SHG信号，但参加乙醇后唯一的条件改变却可以观察到其SHG，推测可能是乙醇诱导活细胞内DNA构象发生了变化致使DNA的非线性光学特性发生改变从而使得变构后的DNA满足了产生SHG的条件，并最终探测到了其SHG信号。目前，关于乙醇诱导溶液中DNA分子构象之间的转变已经被广泛研究19-22，参加乙醇到DNA溶液中

28、使溶液中水活性降低，致使结合到DNA上的水分子数减少，原来被水分子支撑而伸展的DNA沟槽收缩，大沟槽变得更窄更深，小沟槽变得更宽更浅，使DNA整体外形构造变得更短，从而导致DNA构象由B型转化为A型，这种构型的转变将改变双螺旋构造中大沟槽和小沟槽的氢键类型23-25。在体内，这种类型的影响取决于与DNA结合的蛋白质14-15,18。研究说明，DNA随着乙醇浓度的增大稳定性会降低22，推测当参加乙醇到培养的细胞中，乙醇小分子会通过核孔进入到细胞核内，致使DNA的稳定性降低从而使DNA与蛋白质的结合松散，使双链处于较松散的状态，有利于DNA与RNA的结合致使构象发生改变。在活细胞中，由于细胞本身不

29、满足非中心对称构造，每个核苷酸分子产生的二次谐波相互叠加抵消使得我们在实验中并未观测到SHG的产生。参加乙醇分子后，分子外表电荷特性发生改变以及分子螺旋构象形态发生改变，使得每个分子在同样入射光的激发下所产生的超级化强度的方向与之前相比发生改变，进而每个分子产生的二次谐波的方向也发生改变，在我们观察的生物组织区域内，所有的二次谐波相位一致而相互干预加强，满足相位匹配原理18，使得我们在参加乙醇后观察到了SHG。由此，反推2.1和2.2的实验结果，由于在提取基因组DNA和细胞核的试剂中包含了乙醇，推测提取过程中乙醇的参加也会影响DNA的构象，对二次谐波的产生和增强造成一定的影响。此外，参加乙醇分

30、子后细胞的荧光强度也明显增强图3。其原因可能是由于乙醇介入蛋白质分子，改变蛋白质分子所处环境的介电常数，引起肽链伸展，从而降低了某些氨基酸如色氨酸Trp、酪氨酸(Tyr)残基的微环境极性，使得Tyr残基形成的氢键遭到破坏，以致处于淬灭状态的Tyr残基荧光得以恢复，并使其量子率增加。另外可能的原因是参加乙醇可使细胞起到脱水作用，降低细胞所处的微环境极性，使得荧光强度增强。4 结论 我们利用SHG-TPEF显微成像技术分别对基因组DNA、细胞核提取物和培养细胞进展光谱成像，结果显示常规条件下可检测到基因组DNA和细胞核提取物的SHG，但无法检测到培养细胞的SHG，乙醇的参加可使得我们在培养细胞中也

31、检测到SHG， 说明乙醇可对DNA的空间构象产生影响，致使DNA光学特性发生改变从而产生二次谐波。由此，反推在基因组DNA和细胞核提取试剂中包含了有机物乙醇，可能对这两组样品的DNA空间构象产生影响，并最终影响二次谐波的产生和增强。同时，在DNA和细胞核的提取试剂中还包含了其它的化学试剂如十二烷基硫酸钠：SDS，乙二胺四乙酸二钠盐：EDTA等也有可能对DNA非线性光学特性产生影响，要得出确切的结论还需要更进一步的研究。References:1 Denk W, Stickler H, Webb W W. J. Science, 1990, 248(4951): 73-76. 2 Gannaway

32、 J N. and Sheppard C J R. J. Opt. Quantum Electron, 1978, 10: 435-439.3 Campagnola P J, W ei M , L ewis A, et al . J. Biophysical, 1999, 77:3341 -3349. 4 Campagnola P J, Clark H A , Mohler W A , Lewis A, et al. J. Biomed. Opt. 6, 2001, 227-286. 5 Campagnola P J, Millard A C, Terasaki M,et al. J. Bio

33、physical, 2002, 81(1):493-508.6 Freund I, Deutsch M, Sprecher A J. J.Biophysical, 1986, 50(4):693-712.7 Meng Han, Lander Zickle r, Guenter Giese, et al. J. Journal of Biomedical Optics, 2004, 9(4):760-766.8 Yi J, Ivan V Tomov, Yim in W, et al. J. Applied Physics Letters, 2005, 86:133901-133903. 9 Ta

34、ke shi Yasui, Yoshiyuki Tohno, Tsutomu A raki. J. Journal of Biomedical Optics, 2004, 9(2):259-264.10 Gauderon R, Lukins P B, Sheppard C J R. J. Micron,2001, 32 (7):685 689.11 Zhuang Zheng-Fei, Liu Han-Ping, Guo Zhou-Yi et al. J. Chin. Phys. B, 2010, 19(4):4262-4265.12 YAN Dan, WANG Zhu-yuan, CUI Yi

35、-ping (严丹，王著元，崔一平). J. Optoelectronic Technology (光电子技术学报), 2008，28 (2):129-135.13 QU Jun-le, CHEN Dan-ni, YANG Jian-jun, et al(屈军乐，陈丹妮，杨建军等). Polytechnic J. of Shenzhen University (深圳大学学报理工版), 2006, 23(1):1-9. 14 Tianshu Luo, Jianxin Chen, Shuangmu Zhuo, et al. J. Frontiers of optoelectronics in Ch

36、ina, 2008(1):33-38.15 Ramanujam N. Neoplasia, 2000, 2:8911716 Martine P F, Catherine V B, Eric T, et al. Tetrahedron, 1996, 52: 1356917 Peng Xiao-bin, LIANG Shi-qiang(彭小彬，梁世强). J. Chemical Progress (化学进展), 2001, 13(5):360-367.18 Stoller P, Kim B M, Rubenchik A M, Reiser K M et al. J. of Biomedical O

37、ptics, 2002 (7): 205-217.19 Brahms J, Mommaerts W F H. J. Mol.Biol. 1964, 10:73 - 88.20 Ivanov V I, Minchenkova L E, Minyat E E, et al. J. Mol.Biol. 1974, 87:817 - 833.21 Minchenkova L E, Schyolkina A K, Chernov B K, et al. J.Biomol.Struct. Dyn. 1986, 4:463 - 476. 22 Li Lai-Sheng, HUANG Wei-dong, YA

38、N Yuan(李来生，黄伟东，鄢远).J. Spectroscopy and Spectral Analysis (光谱学与光谱分析), 2001, 10:685-687.23 Saenger W. Principles of Nucleic Acid Structure (Springer, New York), 1984. 385-431. 24 Seeman N C, Rosenberg, J M, Rich, A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, 73:804-808. 25 Berg O G, Von Hippel P H. J. Mol. Biol. 1987(193):723-750.