定量PCR中-ct值的含义

《定量PCR中-ct值的含义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《定量PCR中-ct值的含义（11页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的奔腾，并且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化限度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、措施及参照问题作一简介。 一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反映体系中加入荧光基团，运用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过原则曲线对未知模板进行定量分析的措施。1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一种很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct

2、值的含义是：每个反映管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。图1. Ct值的拟定 2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反映的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设立是3-15个循环的荧光信号的原则偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表白，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系1，起始拷贝数越多，Ct值越小。运用已知起始拷贝数的原则品可作出原则曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从原则曲线上计算

3、出该样品的起始拷贝数。图2. 荧光定量原则曲线4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料2。现将其原理简述如下：1） TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同步加入一种特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一种报告荧光基团和一种淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸取；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一种荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示。图3. TaqMan 荧光探

4、针工作原理2）SYBR荧光染料：在PCR反映体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增长与PCR产物的增长完全同步。二内标在老式定量中的意义1几种老式定量PCR措施简介3：1）内参照法：在不同的PCR反映管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程措施合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同步，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，两者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板4。2）竞争法：选择由突

5、变克隆产生的具有一种新内切位点的外源竞争性模板。在同一反映管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同步扩增（其中一种引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数5。3）PCRELISA法：运用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最后酶使底物显色。常规的PCRELISA法只是定性实验，若加入内标，作出原则曲线，也可实现定量检测目的6。2内标在老式定量中的作用由于老式定量措施都是

6、终点检测，即PCR达到平台期后进行检测，而PCR通过对数期扩增达到平台期时，检测重现性极差。同一种模板在96孔PCR仪上做96次反复实验，所得成果有很大差别（见图4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所导致的不精确性。但虽然如此，老式的定量措施也都只能算作半定量、粗略定量的措施。图4. 相似模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性三内标对荧光定量PCR的影响 1实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了老式定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软

7、件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据原则曲线获得定量成果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基本之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在达到Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同步间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。（见图4）2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可运用原则曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外原则曲线定量的措施。2内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反映变为双重PCR，双

8、重PCR反映中存在两种模板之间的干扰和竞争，特别当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会体现得更为明显7,8。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，因此无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个因素，老式定量措施虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的措施。美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的措施学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外原则曲线的定量措施是一种精确的、值得信赖的科学方9。Applied Biosystems公司的7700型实时荧光定量PCR仪是全球公认的荧光定量PCR的金原则，可实现多色荧光同步检测，但定量检测仍然采用外原则曲

9、线的措施，而不用内标进行定量。综上所述，运用外原则曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最精确，重现性最佳的定量措施，已得到全世界的公认，广泛用于基因体现研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域10,11,12,13。参照文献1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR

10、-Rev. B Applied Biosystems 3. 定量聚合酶链反映的研究进展与临床应用. 中华检查医学杂志, 23(2): 120-121.4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reaction. J Pharmacol Toxicol Methods, 1997, 38: 13

11、3-140.5. Wuhu A, Waiztu M, Koch A. A rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriprase (CRT) PCR analysis of cellular genes. Brain Pathol, 1998, 8: 13-186. 仝文斌，高巍，费然等. 核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测措施. 中华医学检查杂志，1999, 22: 83-86.7. Actor JK, Limor JR, Hunter RL. A flexible bioluminescent-quantitiv

12、e polymerase reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. J Clin Lab Anal, 1999, 13(1): 40-47.8. Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR). J Theor Biol, 1997, 184(4): 433-440.9. Ke

13、LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol. Cell Probes, , 14(2): 127-135.10. Becker K., D. Pan and C.B.Whitely. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther, 1999, 10: 2559-2566.11. H

14、iggis, J.A., etal. 5 nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits. J Clin Microbiol, 1998, 36: 2284-2288.12. Bieche I., P.Oondy, etal. Real-time reverse transcription-PCR assay for future nagement of ERBB2-based clinical apolications. Clin.Chem, 1999, 45: 1148-1156.13. Wang X. X. Li, etal. Applicati

15、on of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. ,Neurosci.Res, 59(2): 238-46.荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念基线（Baseline）：是指在PCR扩增反映的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。荧光域值（threshold）的设定：一般将 PCR反映前 15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧

16、光域值是PCR第315个循环荧光信号原则差的10倍，荧光域值设定在 PCR扩增的指数期。CT值：表达每个PCR反映管内荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表白，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。运用已知起始拷贝数的原则品可作出原则曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从原则曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩增曲线PCR过程中，以循环数为横坐标，以反映过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线 判断扩增曲线与否良好的指标重要有几种方面：1、曲线拐点清晰，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。3、原则的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。4、各管的扩增曲线平行性好，表白各反映管的扩增效率相近。熔解曲线对PCR产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，达到某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。运用该特点以及不同PCR产物其Tm值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对PCR的特异性进行鉴定。