免疫组化原理、步骤及要注意的事项.

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1、免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原 位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量 测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来， 借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞 水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体 的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的 关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病

2、的发病机理和病理过程。免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物 的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显 微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可 将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记 的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性 强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶 标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化 间接染色法。三，免疫组化步骤1, 切片，烤片60C, lh；2, 脱蜡及

3、复水二甲苯lOmin，100%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min， 80% 乙醇5min， 75% 乙醇5min，60% 乙醇5min，50% 乙醇5min，30% 乙醇5min， 自来水lmin，双氧水lmin；3，1份30%H2O2加10份蒸馏水，室温10min,蒸馏水洗3次，每次3min；4微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98C-100C ）加热至沸腾， 冷却（约5-10min），反复两次；5, 将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6, 封闭，5%BSA，室温20min,甩去多余液体；7, 滴加一抗，37C,

4、 lh,或者4C过夜；8, PBS洗涤3次，每次3min；9, 滴加二抗，37C, 15-30min；10, PBS洗涤3次，每次3min；11, 滴加 SABC,37C, 30min；12, PBS洗涤3次，每次5min；13, 1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14, DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15, 自来水冲洗干净，过蒸馏水；16, 苏木素复染2min，自来水冲洗；17, 脱水30% 乙醇3min, 50% 乙醇3min, 70% 乙醇3min, 80% 乙醇3min, 90% 乙醇3min, 95% 乙醇3min, 100% 乙醇3min

5、,二甲苯20min；18, 树胶封片，镜检。四，免疫组化常见问题分析1, 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织 上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。2, 边缘效应1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组 织下面试剂洗尽所致.解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出 尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死 较

6、多的组织；2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心 组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用 组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。3, 产生组织切片非特异性染色1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二 抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组 织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长

7、二抗来源的动物免疫血清封闭时 间和适当增加浓度来加强封闭效果；5）DAB孵育时间过长或浓度过高；6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸 洗尤为重要；7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。4, 免疫组化染色呈阴性结果1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位, 以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是 最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；3）组织切片本身这种抗原含量低；4）血清封闭时间过长；5）DAB孵育时间过短；6）细胞通透不全，抗体

8、未能充分进入胞内参与反应；7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方 法问题。5, 背景1，考虑一抗浓度高；2, 然后调整DAB孵育时间；3, 也要考虑血清封闭时间是否过短；4，适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。免疫组化的经验总结（1）一常见问题免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。1、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组 织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片 是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片， 有

9、利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对 组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标 本制作方法。2、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法?石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分 抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC 染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏， 而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法， 酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是PH6.0的O.Olmol/L的柠檬酸盐缓冲 液。3、免疫组化常用的染色方

10、法有哪些?根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一 种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更 高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素抗生物 素染色法最常用。4、抗体的保存:抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼 硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低(10-100mg/L),就应另加隔离蛋白以 减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多 数已稀释的抗体应存在4C -8C条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗 体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于

11、-20C条件下，并避免反复冻融。冷 冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污 染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细 菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20C以下 可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进 行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当， 可在4C下保存数月。多聚赖氨酸溶液(Poly-L-Lysine Solu tion )多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织 切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强

12、的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理， 以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养,增加细胞贴壁能力。 操作步骤(可直接在玻片上涂布)1. 灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。2. 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26 C3. 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。4在60 C烘箱1小时干燥，或室温18-26C过夜干燥待用。注意1. 每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张，超过90张片子将影响其黏合力。2. 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% H

13、Cl的70%乙醇溶液来清洗。4. 释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8C，至少在3个月内是稳定的。5. 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。免疫组化的经验总结(2)操作规程(一) 、仪器设备1) 18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2)水浴锅(二) 、试剂1) PBS 缓冲液(pH7.27.4)： NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。2) 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB, pH6.0, 1000ml)：柠檬酸三钠3g, 柠檬酸0.4g。3) 0.5mol/L EDTA 缓冲液(pH

14、8.0)： 700ml 水中溶解 186.1gEDTA 2H20, 用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0,加水至 1000ml。4) 1mol/L 的 TBS 缓冲液(pH8.0)：在800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。5) 酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4% 胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6) 3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7) 封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.09.5)等量混合；b、油和TBS(或PB

15、S)配制。8) TBS/PBS pH9.09.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4适合于光 学显微镜标本。(三) 操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60 r恒温箱中烘烤20分钟。1) 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2) 无水乙醇中浸泡5分钟；3) 95%乙醇中浸泡5分钟；4) 70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1) 抗原热修复(1) 高压热修复在沸水中加入EDTA (pH8.0、或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖 上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢

16、加压，使玻片在缓 冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中， 当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。(2) 煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95C左右，放 入组织芯片加热1015分钟。(3) 微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片 放入，断电，间隔510分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR, Bax, Bcl-2, C-fos, X-jun, C-kit, C-myc, E-cadherin, p53, p34, p16, p15, P-g

17、lycoprotein, PKC, PR, PCNA, ras, Rb, Topoismerase II等。是以高温，高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种 非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联过程中 氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120C高温或强碱 处理后，可使交联打开。2）酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37C，切片 也预热至37C，消化时间约为530分钟；胃蛋白酶消化37C时间为30分钟。适用于被固定遮 避的抗原，其中有：Collagen， Complement,

18、 Cytokeratin, C-erB-2, GFAP, LCA, LN 等。3、免疫组织化学染色SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗23次各5分钟；3）3%H2O2 （80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗23次各5分钟；5）抗原修复；6）PBS洗23次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加I抗50p l,室温静置1小时或者4C过夜或者37C1小时。9）4C过夜后需在37C复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加II抗4050p l,室温静置，或37C1小时；12）II 抗中可加入0.05%的 tween-20。13）PBS洗

19、3次各5分钟；14）DAB显色510分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗1015分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法 1）脱蜡、水化。2）PBS洗两次各5分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7）滴加I抗，室温1小时或者4C过夜或者37C1小时（4C过夜后在37C复温45分钟）。8）PBS洗三次每次2分钟。9）滴加生物素化二抗,20C37C20分钟。10）PBC洗3次每

20、次2分钟。11）滴加试剂SABC, 20C37C20分钟。12）PBS洗4次每次5分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。免疫组化的经验总结（3）操作要点和技巧1. 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对 于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐 的固定液，请于购置前注意说明书。Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强， 固定较好，结构完整，但因偏

21、酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本 的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微 结构及许多抗原的抗原性保存较好。2. 组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3. 切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4烤片：60C 30分钟或37C过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5蜡块及切片的保存：最好在4C保存6脱片问题：Poly-L-Lysine（多聚赖氨酸）为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防 脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合

22、于需要酶消化、微波、 高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以 上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1： 50丙酮溶 液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。7.灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。8暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助 于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度（不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说 明书）。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热 修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用

23、胃蛋白酶消化等。9. 封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封 闭10. 抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11. 背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可 采用含1%。Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。12返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HP04的饱和溶液返蓝。13.显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。DAB法显示过氧化物酶原理 过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2 （供氢体）+H2O2 A （供氢体的氧化物）+2H2O2

24、实验可知，有称为复合物I、II、III、的酶一一底物（受氢体） 复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化 学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。免疫组化染色步骤（以ABC法为例）溶液的配置：1. 0.1M PBS 2000ml: NaCL 18g, NaH2P04 2H2O 0.8g, Na2HP04 12H20 12g.共六份2. 柠檬酸盐缓冲液：贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）： 21.01g柠檬酸+ 1L蒸馏水0.1M柠檬酸三钠溶液（B）： 29.41g柠檬酸三钠+ 1L蒸馏水工作液：9ml A液+41ml B液+450m

25、l蒸馏水一0.01M柠檬酸盐缓冲液3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 纯甲醇充分混匀4. 20%甘油：80ml纯甘油+ 320ml蒸馏水5. 稀释抗体：1 ： 300 , 1 : 400 , 1 : 600 （临用前配）6酒精的配置 染色步骤：一步法1. 载玻片烤箱中60C 40。2. 二甲苯I, 60C 20（水浴箱中），二甲苯II,室温15。3. 脱水，100%95%85%75%酒精，每级均为3。4. 蒸馏水冲洗，PBS 5* 15微波炉修复抗原：0.01M柠檬酸盐缓冲液，99C肺20，心肾126. PBS 3*37. 0.03% H2O2-甲醇

26、，室温 208. PBS冲洗，PBS 3*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAP Pen划境线。9. block solution 封闭抗原，室温 10。10倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul），4C过夜或37C 12h。11. PBS 冲洗，3*3。12. 除去PBS,滴加A增强剂，室温25。13. PBS 冲洗，3*3。14. 除去PBS,滴加B剂，室温35。15. PBS冲洗，3*3。同时配置DAB显色剂。16. 除去PBS，DAB显色10（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。17. 复染：苏目素均匀滴加2滴，40，蒸馏水冲洗，60C温水泡半分钟。18. 脱水：

27、75%酒精一85%f95%fl00%（3次），每级3。19. 透明：二甲苯13,二甲苯113。18.封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60C 0.5h烘干。结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。拍照1. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一 次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。2. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间， 同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中 空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动 白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不 偏黄，也不偏蓝。