ABI公司7000型荧光定量PCR仪中文操作手册vC

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1、美国应用生物系统公司ABIPrism7000型荧光定量PCR仪操作手册目录.开机3实时定量的软件运行31. 新建文件32. 探针设置43. 填样品表44. 参比荧光55. 循环参数56. 启动扩增5三. 实时定量的数据分析61. 数据分析62. 基线设定63. 线性图谱64. 原始数据75. 标准曲线76. 实验报告7四. 终点读板的软件运行71. 新建文件82. 探针(DETECTOR)设置83. 位点(MARKER)设置84. 填样品表85. 参比荧光86. 终点读板9五. 终点读板的数据分析91. 数据分析92. 信号分布93. 基因分型94. 保存结果9六. 日常维护101. 荧光污染

2、的检査与处理102. 检测器光源的更换流程10ABIPrism7000型荧光定量PCR仪快速入门指南开机1. 确认电脑与丄机的数据通讯线（灰色USB连线）连接止确。2. 确认电脑处于外接电源供电状态。3. 启动电脑，以Administrator用户名登录，进入Windows2000操作系统。4. 待桌面图标出现后，打开7000主机的电源。5. 待主机的电源指示灯点亮后，启动7000SDS应用软件。鹹7000跑讪neeDetectionSystem.实时定量的软件运行基因表达的绝对定量和相对定量研究、转基因食品的检测（GMO）、各种病原体的检验检疫等各种定量应用；以5值的大小作为样品阴性、阳性判

3、定依据的定性应用；以及SNP检测、等位基因鉴定实验等的第-步PCR扩增，都是采用实时定量模式，按照以下步骤操作。1. 新建文件菜单File-*New,Assay选择AbsoluteQuantification（实时定量模式），打开一个空白的96孔板文件。131*|O1AU4ABIPrism7000中文操作手册2. 探针设置双击任意一个孔，打开WellInspector窗口。该窗口也可以从菜单View-*WellInspector打开。3. 首次使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击AddDetector按钮，打开DetectorManager窗口。该窗口也可以从菜单Tools

4、-*DetectorManager打开。如果Detector列表中没有合适的探针，点击按钮File-New,新建探针：设定探针的名称健议使用所研究基因符号，如GAPDH、ACTIN等）、报告基团（FAM或者VIC）、淬灭基团（TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None）、颜色（任意指定）等。设置完成后点击OK,该探针即出现在探针列表中。重复此过程，设立其他的探针。4. 在DetectorManager窗口，从探针列表中点击选择所需探针，按住Ctrl键可以选择多个探针，再点击AddtoPlateDocument按钮。最后点击Done关闭DetectorManager窗口。此时WellIn

5、spector窗口仍然是打开的。5. 填样品表在96孔表中选定有样品的-个或多个孔，在WellInspector页面的SampleName栏中填入样品名称；在探针列表的Use项下的方框中，打钩选择要用的个或多个探针；在Task栏中选择指定样品类领：阴性对照选NTC；未知样品选Unknown；标准品选Standardo对于Standard,还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注意：只有在这里输入拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。建议标准品的浓度在5点以上。建议每个样品（包括标准品）都按照统计学要求作定数量的复管。6. 参比荧光如果使用的是ABI公司的定量PCR试剂，如TaqManUni

6、versalPCRMasterMix或者SYBRGreenPCRMasterMix等，参比荧光(PassiveReference)选ROX：如果使用的试剂中不含有参比荧光，请选None。完成后点击右上角的X按钮，关闭WellInspector窗口。7. 循环参数切换到Instrument页面，设定及修改PCR热循环程序：在ABI公司默认的程序中，50C2min是UNG酶起作用的步骤，UNG酶可以预防其他PCR扩增的产物(其中以U代替T)对定量PCR的污染；95C10min的作用是激活金牌Taq酶，同时灭活UNG酶；40个循环的95915sec和60C1min是定量PCR的循环步骤。7000默认

7、在最后一步，也就是60C1min复性和延伸时收集荧光信号。如果使用ABI公司的定量PCR试剂，上述参数不需要调整，戌接运行PCR循环就可以了。在使用其他厂家试剂的情况下，如果其中没有UNG酶，请删除50C2min步骤;如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶，请删除95C10min步骤。8. 循环参数的修改方法删除：按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击，该步骤被选中变黑，按Del键即可删该步骤或循环。插入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖线后，分别点击AddHold.AddCycle或AddStep按钮添加保温、循环或循环中的-个步骤。修改温度和时间：拖动鼠标，选中

8、需要修改的温度或时间数字，输入新的数值即可。9. 其他设置反应体积：定量PCR的标准反应体积是50pL；如果想修改的话，建议大于25pL融解曲线试验：在DissociationProtocol选项左边的方框中打钩，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是采用SYBRGreenI染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验，以判足PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物，多峰表示PCR扩增有杂带。注意：只有SYBRGreenI染料方法才需要进行融解曲线试验，TaqMan探针和MGB探针法都不需要。9600Emulation：选中此项，即可使7000的升降温速度减慢，与9600

9、和7700-样,从而可以直接使用在9600、7700型PCR仪上优化好的循环条件，而不需任何修改。10. 启动扩增点Save按钮保存文件设置。确认96孔板或全部样品管在上机内放置妥当后，点击Start按钮，开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。6ABIPrism7000中文操作手册门监控进程切换到Results页面的AmpPlot（页面，可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC,只显示对应探针的变化情况；如果选All,则同时显示所有探针的反应进程。12.保存结果程序结束后，点Disconnect按钮，然后File-Save保存实

10、验结果。可以保存为.sds格式，也可以保存为.sdt格式，作为以后同类实验的模板，节省软件设置时间。三. 实时定量的数据分析1. 数据分析切换到Result页面，进入扩增曲线（AmplificationPlot）犷页面，查看软件己经自动分析好的实验结果。注意：此时的数据是软件根据默认值（基线起点为3,终点为15）得到的初步结果，还需要根据本次实验的具体情况，精细调节Baseline（基线）的起止点后，重新分析，以得到更精确的数据。2. 基线的起点和终点确定原则某线（Baseline）是指PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高，设在信号已

11、经降到背景高度且能维持平稳的地方，-般在3到6个循环之间；终点要避免覆盖信号己经开始有明显增长的地方，一般在本组数据中最小的6值前再3个循环处。另外，起点与终点之间最好能间隔8个循环以上，以满足统计基线标准偏差的数学要求。调整好起止点以后，再点击Analyze按钮，软件即自动计算新的阈值和6值，并更新实验报告。注意：此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新，但是这不影响后台数据运算的准确。3. 线性图谱在默认的设置中，PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校止后的相对荧光信号强度，横坐标代表PCR循环次数（从1到40）；纵坐标以对数表示，横坐标以线性表示。如果要看完全线性的S形图谱，请

12、双击纵坐标轴线，打开坐标设置窗口，将纵坐标改成线性形式。4. 原始数据切换到Component(页面，察看原始数据。止常的FAM信号强度，基线时约为5000点，扩增完成达到约28000点，中间呈S形增长；TAMRA和ROX的信号开始时都比FAM的某线要稍低-点，TAMRA信号到指数增长阶段会降低，而ROX信号是水平稳定的，不随PCR进程而改变，因为ROX是以固定浓度加入到PCR试剂中的，它本身并不参与PCR扩增。5. 原始数据切换到Spectra/页面，也可以察看原始数据oSpectra与Component这两个页面的区别是：Component显示的是信号强度随时间(即PCR循环次数)的变化，

13、是纵向的；而Spectra显示的是每个PCR循环点上信号强度在不同波长上的分布，也就是在4个滤色片上的分布，是横向的。6. 标准曲线切换到StandardCurve(页面，察看标准曲线。注意：只有在Setup时输入标准品的拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。8ABIPrism7000中文操作手册#ABIPrism7000中文操作手册7. 实验报告切换到ReportC页面，察看实验报告。确认无误后，保存结果。也可以从File菜单中选择Export,再选择数据类型，输出各种类型的数据，包括Ct值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数据和实验结果等。输出的数据可以用Excel打开，并可在Excel中重

14、新生成扩增曲线、标准曲线等图谱。四. 终点读板的软件运行各种等位基因鉴定实验，包括SNP检测、基因突变检测等，都包括两个阶段：1、PCR扩增；2、扩增后的荧光信号读1R(Post-read)和数据处理。笫一步既可以在9700、9600等普通的PCR仪上进行，也可以在7000、7900等定量PCR仪上进行；第二步9AS勰擴酩ABIPrism7000中文操作手册必须在定量:PCR仪上进行。以下只叙述笫二步Post-Read和数据处理的操作方法。如果第-步也在定量PCR仪上进行，请按第三节实时定量的实验方法设置和运行软件；待PCR完成、数据保存好后，再将同一块板放在7000,按以下步骤操作。1. 新

15、建文件菜单FileNew,Assay选择AllelicDiscrimination（终点读板模式,用于SNP分析等），新建一个空白96孔板文件。LamPtkraranwiimwcIHiri|.Itf0色岂AiKaiuFTf2. 探针设置双击任意一个孔，打开WellInspector窗口。该窗口也可以从菜单ViewWellInspector打开。3. 首次使用软件，或者Marker没有设置好，先点击AddDetector按钮，打开DetectorManager窗口。该窗口也可以从菜单Tools-*DetectorManager打开。如果Detector列表中没有合适的探针，File-New,新建

16、探针，设定探针的名称（建议使用等位某因的名称，如Allele1、Allele2等）、报告某团（FAM或者VIC）、淬灭基团（TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None）、颜色（任意指定）等。设置完成后点击OK,该探针即出现在探针列表中。4. 位点设置Detector设置好后，点击AddMarker按钮，打开MarkerManager窗口。该窗口也可以从菜单Tools-*MarkerManager打开。如果在Marker列表中找不到合适的探针，点CreateMarker,取名（建议使用位点的名称，如D2S1356等），OK.新位点的名字即出现在左边的位点列表中，选中位点，在右边的探针列表

17、中打钩选择与该位点配套的探针，一般FAM、VIC各一个组成一套。5. 选择位点Marker设置完成后，在左边的位点列表中选中该Marker,点击CopytoPlateDocument按钮，该Marker的信息即分成3行出现在WellInspector窗口中。重复选好全部所需Marker,再点击Done关闭MarkerManager窗口。注意：定量PCR实验只要求设置探针（Detector）UP可，而SNP实验既要设置探针（Detector）,还要设置位点（Marker）o如果没有设置Marker,软件将不能进行基因分型。6. 填样品表在96孔表中选定有同类样品的个或多个孔，在WellInspe

18、ctor页面的Marker列表的Use项下的方框中打钩，选择要用的Marker,然后在探针的Task栏选择指定样品类型：阴性对照选NTC：未知样品选Unknowno没有Std。7. 参比荧光如果用的是ABI公司的PCR试剂，如TaqManUniversalPCRMasterMixwithorwithoutUNG,参比荧光（PassiveReference）选ROX；如果所用试剂中不含ROX参比荧光，请选None。点击右上角的X按钮关闭WellInspector窗口。8. 循环参数切换到Instrument页面。PCR热循环程序只有60C-个步骤，不需要修改。设置反应体积。SNP的标准反应体积是

19、50|JL。点Save按钮保存文件设置。9. 终点读板确认96孔板或全部样品管在丄机内放置妥当后，点击Post-read按钮,开始读取数据，大约10秒完成。10. 保存结果程序结束后点Disconnect按钮，然后File-Save保存实验结果。五. 终点读板的数据分析1. 数据分析切换到Results页面,Allelicdiscrimination了页面,在Marker下拉菜单中选择要査看其数据的Marker,在下面96孔板界面中按Excel方式选择需要査看的样品孔，软件即在中间的图谱上显示信号的分布情况。选择不同的Marker,显示不同的信号。可以点击放大或缩小工具调整图谱的大小。2. 信

20、号分布止常的信号应该分为4组，靠近原点处为NTC；靠近X轴的是VIC信号，是纯合了，其止常信号强度范围在2-8Z间；靠近丫轴的是FAM信号，是另一种纯合其止常信号强度范围在416之间；靠近对角线位置的样品中既有FAM信号也有VIC信号，是杂合了，强度为FAM和VIC各自的-半左右。3. 基因分型点击套索工具，然后通过鼠标圈定NTC信号，在Call下拉菜单中选NTC,这些数据点即被分型为NTC并显示相应的颜色和图标；同样分型FAM纯合了、VIC纯合了和杂合了。4. 保存结果切换到Report页面看实验报告。确认无误后，保存分析结果。也可以从File菜单中选择Export,再选择数据类型，输出各种

21、类型的数据。11ABIPrism7000中文操作手册六. 日常维护1.荧光污染的检查与处理新建一个空的96孔板，菜单Instrument-*Calibrate打开ROIInspector窗口，将ExposureTime调到4096,选定FilterB,点击Snapshot按钮（不要动下面两个按钮，以免ROI设置出错），此时可以看到排列整齐的96孑L图像。如果观察到特别明亮的光斑，则表明该孔存在荧光污染。将光标移动到单个孔的上方可在右侧栏中的PixelIntensity处读出该孔的荧光信号值，超过500以上的需要淸洗。清洗时尽量使用较细且无硬物突出的干棉签擦拭；如果未能去除，可用去离了水清洗；如污垢顽固，可使用90%乙醇消洗，但要等乙醇完全挥发干净后方可盖上热盖，以免有机溶剂损伤热盖上的透镜组。12ABIPrism7000中文操作手册#ABIPrism7000中文操作手册2.检测器光源的更换流程关机冷却约15分钟后，打开仪器顶部盖板，拧松灯泡保护罩的螺钉，取下保护罩，将灯泡拆下，更换新的灯泡并插好连线。注意：备用的新灯泡必须保存在干燥环境中。screwandIrtV#ABIPrism7000中文操作手册#ABIPrism7000中文操作手册(Lastrevised:2003-08-07)#