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1、会计学1第第10章基因诊断章基因诊断GenediagnosisChinaMedi第1页/共63页第2页/共63页第3页/共63页基因诊断的特征：基因诊断的特征：1 不受材料来源影响不受材料来源影响 外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2 症状前诊断症状前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病如尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病舞蹈病3 产前诊断产前诊断 避免患儿出生，提高人口质量避免患儿出生，提高人口质量第4页/共63页第一节第一节 基基 因因 诊诊 断断 技技 术术Southern印迹杂交印迹杂交第5页/共63页基基 因因 诊诊 断断
2、技技 术术Northern印迹杂交印迹杂交第6页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术斑斑 点点 杂杂 交交点样点样Probe-32P检测检测AB1 2 3 4第7页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧光原位杂交荧光原位杂交第8页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术荧光原位杂交荧光原位杂交第9页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术聚合酶链反应聚合酶链反应第10页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术聚合酶链反应聚合酶链反应第11页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 多重多重PCR在一个在一个PCR体系中加入数对体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不
3、重叠引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失用于检测同一基因多个外显子的缺失E1 E2 E3第12页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 RT-PCR以以mRNA为模板，经逆转录酶合成为模板，经逆转录酶合成cDNA用于研究基因表达用于研究基因表达使微量使微量mRNA迅速扩增，提高迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度检出的灵敏度第13页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 PCR-SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism）单链单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或
4、相近长度的单链差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率电泳迁移率的不同。据此，可用于的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。小的缺失或插入的检测。第14页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术 -primer -32P-dNTP掺入掺入 PCR扩增扩增 产物产物 变性变性 单链单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影自显影 1为正常为正常 结果分析结果分析 2、4、5为纯合患者为纯合患者 3为杂合子为杂合子 .第15页/共63页基基 因因 诊诊 断断 技技 术术生生 物物 芯芯 片片第16页
5、/共63页第二节第二节 基基 因因 诊诊 断断 方方 法及法及实例实例直接诊断直接诊断直接直接检测致病基因的突变检测致病基因的突变 基因突变类型基因突变类型缺失、点突变、重复、插入等缺失、点突变、重复、插入等间接诊断间接诊断应用应用DNA多态为遗传标记进行连锁多态为遗传标记进行连锁 分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而从而间接间接地作出诊断地作出诊断 DNA多态多态RFLP、VNTR、SNP第17页/共63页第18页/共63页第19页/共63页第20页/共63页Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouth
6、ern blot检测结果检测结果 第21页/共63页第22页/共63页第23页/共63页第24页/共63页大小第25页/共63页第26页/共63页第27页/共63页第28页/共63页三三)单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNP）（Single Nucleiotide Polymorphism）SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据根据SNP在基因中的位置，分为：在基因中的位置，分为：基因编码区基因编码区SNP 基因周边基因周边SNP 基因间基因间SNP在人类基因组中每在人类基因组中每100300个核苷酸就有一个个核苷酸就有一个SNP第29页/共63页直接
7、直接基因诊断及实例基因诊断及实例第30页/共63页第31页/共63页第32页/共63页度发生变化。度发生变化。第33页/共63页第34页/共63页等位基因特异性寡核苷酸探针（等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide）第35页/共63页突变突变直接直接第36页/共63页突变突变直接直接第37页/共63页BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe 1）地中海贫血的基因诊断地中海贫血的基因诊断 基因不同程度的缺失可引基因不同程度的缺失可引起不同类型的起不同类型的 地中海贫血地中海贫血。第38页/共63页So
8、uthern blot 检测结果：检测结果：/-/-/-/-正常正常 缺缺1 缺缺2 缺缺3 缺缺414kb10kb缺失缺失直接直接第39页/共63页缺失缺失直接直接第40页/共63页缺失缺失直接直接第41页/共63页3）DMD的基因诊断的基因诊断DMD属属XRDMD基因是最大的基因，有基因是最大的基因，有79个外显子个外显子DMD基因突变主要以基因突变主要以缺失缺失为主，可涉及基因的不同部位为主，可涉及基因的不同部位E1 E2 E3缺失缺失直接直接第42页/共63页病例外显子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113缺失缺失直接直接第43页/共63页第4
9、4页/共63页 连锁分析基于连锁分析基于遗传标记遗传标记与与Gene在染色体上连在染色体上连锁，锁，通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种子代获得某种遗传标记遗传标记与与疾病疾病的关系，间接推断的关系，间接推断受检受检子代是否获得带有致病基因的染色体子代是否获得带有致病基因的染色体，间接，间接地判断并做出诊断。地判断并做出诊断。遗传标记是基因组中的遗传标记是基因组中的DNA 多态多态 如：如：RFLP，VNTR 等。等。间接基因诊断间接基因诊断第45页/共63页遗传标记相关基因表型分析间接基因诊断间接基因诊断第46页/共63页间接基因诊断间接基
10、因诊断第47页/共63页间接基因诊断间接基因诊断第48页/共63页间接基因诊断间接基因诊断第49页/共63页 以以3HVR为探针，与为探针，与PvuII酶切后的家系有关成酶切后的家系有关成员的基因组员的基因组DNA进行进行Southern Blot 基因组基因组DNAPvuII酶酶切切DNA片段片段变变性性转膜转膜探针探针变变性性杂交杂交结果分结果分析析间接基因诊断间接基因诊断第50页/共63页 1 2 1 2 3 4 5 间接基因诊断间接基因诊断第51页/共63页结果分析结果分析 患者（患者（I1、II1和和II2）有片段，说明）有片段，说明致病基因与片段连锁，并按孟德尔方式致病基因与片段连
11、锁，并按孟德尔方式遗传。遗传。II5不含片段，产前诊断正常。不含片段，产前诊断正常。间接基因诊断间接基因诊断第52页/共63页p1p2142bp99bp43bpBcl IBcl I-Bcl I+间接基因诊断间接基因诊断第53页/共63页间接基因诊断间接基因诊断第54页/共63页 142bp99bp1 2123III 1间接基因诊断间接基因诊断第55页/共63页间接基因诊断间接基因诊断第56页/共63页析方法称析方法称单体型分析单体型分析（Haplotyping)间接基因诊断间接基因诊断第57页/共63页间接基因诊断间接基因诊断第58页/共63页IIIHind Sph 间接基因诊断间接基因诊断第59页/共63页间接基因诊断间接基因诊断第60页/共63页间接基因诊断间接基因诊断第61页/共63页第62页/共63页
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