质粒DNA的提取碱变性提取法

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1、质粒DNA提取-碱变性提取法山东大学生命科学学院08级生命基地2010年10月31日星期日质粒DNA提取碱变性提取法栾一山大南路27号 质粒DNA的提取碱变性提取法实验目的：1 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。仪器和材料； 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器；1.5ml离心管，50ml离心管；不同型号的的枪尖等。菌体：E.coliDH5 受菌体，具有AMPr标记的质粒PUC19。实验试剂： LB培养基，抗生素，溶液I，溶液II，溶液III，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚等。试验原理：碱裂解法是较常用质粒的提取的方法。其优点是收获率高

2、，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。该方法操作简单，易于操作,一般实验室均可进行。十二烷基磺用于进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA

3、则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等.DNA粗提取所用的三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸；溶液I：任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠

4、杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果缺少溶液I，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。不过菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。溶液II：是用新鲜

5、的0.4 N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提法。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。这一步要记住两点：第

6、一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。溶液III：它加入后就会有大量的沉淀，大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了

7、十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被SDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因

8、组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了SDS沉淀更充分一点。试验准备：1、 溶液:pH8.0GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L TrisHCl）；2、 溶液：0.2mol/LNaOH(内含1的SD

9、S)，这个用的时候需现配。要新配置溶液是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。3、 溶液：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；4、 异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1左右，小分子所需PEG浓度高达20。5、 pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTrisHCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20ug/ml。实验步骤1、 配制LB液体培养基，灭菌枪尖（1000ul/200ul/20ul）、2

10、个50ml离心管，吸管，三角瓶等。2、 把E.coliDH5接种到含20mlLB和氨苄青霉素培养基中，在37摄氏度下，过夜培养。（注意无菌操作，防止杂菌干扰试验。）3、 从摇床中取出过夜培养的细菌，轻轻混匀，取2-3ml菌液转接到含50ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 160r/min振荡培养过夜或至对数生长晚期。（经过一夜的培养，液体培养基底部浑浊，菌体大量沉淀。）4、 先称量50ml灭菌离心管的质量m1，然后取一定量的菌体培养液于其中，7000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体。 5、 沉淀中加5ml用冰预冷的溶液I，充分混合（需要剧烈振荡）。7000rpm离心5min，弃上

11、清液，收集菌体。离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。称量其质量m2。（m2-m1是菌体湿重，干燥时使离心管口向下，直到看不见液滴。加入离心管前，混匀菌体。加入溶液I时，一定要打散菌泥）。6、按湿菌体质量：溶液I质量=100mg：1ml的比例加入用冰预冷的溶液I，剧烈震荡，使菌体完全分开。冰浴5min。（打散菌体可用吹吸助溶，或漩涡振荡器。这一步主要是悬浮菌体）7、以二倍溶液I的体积量加入溶液II,慢慢颠倒，使之混匀（切勿剧烈震荡！），将离心管置于冰上5min,此时，溶液粘稠如蛋清。（滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻振溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，它也会破坏质粒DN

12、A，如果操作慢时，可适当减少冰浴时间。G-细胞壁薄，所以强碱足以损坏细胞壁，不需要额外添加酶。加入溶液II，轻振后，溶液变得粘稠。）8、以1.5倍溶液I的体积加入冰浴后的溶液III，轻轻颠倒数次混匀，使之在粘稠的细菌裂解物中分布均匀，将离心管置于冰浴5 min 。（加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，在冰上静置后，沉淀沉在溶液底部。溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡，可放冰上使它自己混匀。）9、以4，12000rpm离心15min，取上清液于另一新离心管中。（白色沉淀聚集在离心管一侧，上清液澄清。取离心管时，不改变其倾斜度，斜着插进枪尖，切勿触碰下部沉淀，吸取时，计算上清液体积。尽

13、可能多的吸取上清液。）10、向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20下沉降30分钟。（加入上述溶液后，溶液变浑浊，不过浑浊程度明显小于加入溶液III。高浓度的盐有利于质粒的沉降。）11、以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有的液体流出。12、向DNA沉淀中加入70%冰乙醇5ml，以12000rpm离心5min，（离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上。（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体打到沉淀的对面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。离心时，小心放置离心管

14、位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，在离心管上标记质粒所在位置是必要的。）13、将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，转移到一个Eppendorf管中，加入RNase A（纯浓度50ug/ml），37保温1小时。（加入TE溶液溶解质粒时，可以用600ul溶解，400ul冲洗未完全转移的质粒。吹吸助溶时，用黄色枪尖吸取溶液，打在刚刚标记的质粒位置的上面，由于质粒本身黏着，容易产生气泡，枪尖溶液快打完时，不要把枪尖插入溶液中。加入酶后混匀溶液保温。）14、将上述的溶液平均分配到2个1.5ml的微量离心管中，每管0.5ml，分别

15、加入与溶液等体积的饱和苯酚溶液，振荡混匀，以4，7000rpm,离心5min，取上层水相到一洁净的Eppendorf管中。（苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。苯酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。通过两个离心管液体高度的比较，加入与原来溶液相同体积的苯酚。苯酚加入后，放平离心管，混合均匀。离心后，取离心管时不改变离心管的倾斜角度，用黄色枪尖吸取上层清液。尽可能多的吸取上清液，但不要吸入蛋白质。）15、加入等体积的苯酚/氯仿溶液（1:1），振荡混匀，以4，7000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的Eppendorf管中。（此

16、时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但相信仍有蛋白质的存在。）16、加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀，以4，7000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的Eppendorf管中。（苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。）17、向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20下沉降30分钟。以12000rpm,离心15min，弃去上清液。（加入高盐和乙醇后，有少量的DNA生成，相对于粗的质粒，含量少了不少。）18、向DNA沉淀中加入70%冰乙醇

17、200ul，以12000rpm离心5min，（离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体打到沉淀的对面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。离心时，小心放置离心管位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。此时质粒呈白色。）19、用100ulTE溶解质粒（先把溶液加入其中一个离心管中，打散沉淀，充分混合，然后把溶液转移到另一个离心管中。）20、按所分离的DNA分子的大小范围，称取0.36g的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入40ml的1TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀

18、，得胶液。冷却至60左右。（加入电泳缓冲液液后，在三角瓶上标好液面位置，再加入5-10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。加热时，放置在微波炉轮盘边缘，用中火加热3min，加热后，若液面低于标线，用枪尖沿着三角瓶边缘慢慢加入。）21、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。22、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。23、待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。24、在槽内加入1TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面25、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上

19、小心混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。(1l加电泳载样液+3l待测DNA样品.)26、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。电泳1h。27、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。28、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约3-5min。29、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。实验结果与分析我们组的点样Puc19和

20、被HindIII切过DNA质粒沉淀离心后,在管底能见到少量白色物质。干燥后，无色，贴于管壁。加ddH2O或TE能迅速溶解。电泳凝胶上呈现一条亮带。如果质粒提取中降解，则会出现上下三条带，分别代表超螺旋、带切口和带切刻的质粒。从图中可以看出除蛋白质很不彻底,虽然已经过多次重复除蛋白质步骤,但从电泳结果分析还是有严重的拖尾现象,点样孔里有亮光，质粒DNA的电泳检测DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,除受分子构型的影响,还受所带净电荷多少的影响。因此在鉴定DNA纯度时,应尽量减少电荷效应。增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应,分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异,由此将不同构型的质粒DNA分

21、开。共价闭合环状DNA(cccDNA)含量越高,表明制备的质粒DNA质量越好。溶解时若不加RNase，则在500bp左右会有很亮的一片，为小分子RNA片段。质粒中含太多杂质，则干燥后会呈白色或褐色，不易溶解。 根据条带亮度，可以大致估计所提取的质粒的含量。标准的样品为200ng，我们组的条带较标准亮。可以估计含量在300ng左右。影响质粒DNA产量的因素：1菌株的遗传背景， 2. 质粒自身的拷贝数。受体菌株一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL-Blue等。endA编码核苷酸内切酶I，在镁离子存在下可将双链的DNA消化成7bp的寡核苷酸片段。这是直接影响质粒产

22、量的重要因素之一。治理本身性质决定的。分子量大的质粒，拷贝数少。质粒产量低。通过凝胶电泳回收的DNA因检测需要而含有溴化乙锭，会影响限制应内切酶的的切割，因此有必要除去插入DNA中的EB。当提取的DNA溶液的浓度达不到实验要求时，必须进行DNA的浓缩。影响迁移率的因素DNA分子的大小；琼脂糖凝胶的浓度；DNA的构象；所加电压 一般5V/cm;电场方向；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。注意事项：1提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净，在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。同时反应中加入的盐浓度一定要

23、控制好，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。一般情况下都是加入的最终浓度达0.10.25mol/L为宜。2该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液与溶液时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒

24、DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理! .3、加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出. 4、加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动45次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。 5、乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(

25、可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。 6、为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带，加入1l RNA酶，将管置50水浴箱内30min，消化RNA。 7、抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三个条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNA。 8、从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时，一定要彻底，不能留有残余。 9 、用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分小心，防止将核酸同洗液一起去掉。 10、在实验过程中所用的器皿和吸头等都要进行高压灭菌。 11 、溴化乙锭 是一种强烈的 致癌物质 ， 使用时必须带手套 。实

26、验结果后，含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。12、加样量不宜过大，引起条带拖尾或跑入其他胶孔，小心加样，不要让样品溢出加样孔。加样梳放整齐，使形成的加样孔整齐，使样品在同一水平位置开始电泳，减少结果偏差。思考讨论1 酚/氯仿提取法即为常规提取方法,在提取时分别按规定添加各溶液逐步使细菌溶解,然后加入酚/氯仿进行抽提,所得质粒DNA具有较高浓度,且纯度也可以,具有较高可行性,是常用的方法。但该方法的缺点在于酚/氯仿提取法中,用苯酚和氯仿进行抽提常常需要离心多次,使质粒DNA损失较大,产率低,操作步骤繁琐,并且饱和酚和氯仿均有很大毒性和挥发性气味,带来诸多危险和不便。异丙醇提取法中延续了常规的酚/氯

27、仿提取法的优点,并用异丙醇代替酚/氯仿进行抽提,尽管异丙醇对蛋白质的变性能力低于苯酚和氯仿,但它能降低分子表面张力,减少抽提过程中所产生的泡沫,质粒提取方法无一例外都包括以下三个步骤: (1)培养细菌使质粒扩增 ；(2)收集和裂解细胞; (3)分离和纯化质粒DNA。2提取质粒时应尽量保护大多数质粒的一级结构的完整性,采取简化操作步骤缩短提取过程等方法,以减少各种有害因素对质粒的破坏。用含一定浓度葡萄糖的溶液悬浮菌体,采用碱性SDS(十二烷基磺酸钠)溶液即溶液裂解菌体的细胞壁,使质粒缓慢释放出来。经溶液处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着与细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械

28、力和核酸酶等的作用而被切断成大小不同的线性片段。溶液是使质粒DNA复性并与染色体DNA分离,加入后置冰上放置35min可以提高质粒DNA的质量和产量。3在经典“碱裂解法”的基础上进行了优化改进,可以获得质量较高的质粒DNA。经典“碱裂解法”的溶液、的比例(l)为100:200:1508,而经过我们反复实验后发现,提取1.5mL菌液时,溶液、比例为(l) 130260195效果会更好。与经典的比例相比,优化后的比例使得菌体裂解更充分,蛋白质和基因组DNA沉淀更彻底,并且不易产生降解的质粒DNA。质粒提取过程中值得注意的是:溶液要现用现配,而且加入溶液前后时间不能过长,否则易掺杂有基因组DNA,所

29、以严格遵守操作规定的时间。当用酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA的两条链不会分离,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段由于分子量很大难以复性,与变性蛋白质或细胞碎片缠绕一起,而质粒DNA分子量小,环状超螺旋结构容易复性,并以可溶状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭合环状质粒以超螺旋形式存在。在质粒提取过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其他形式的质粒DNA。如开环DNA和线状DNA。对提取的质粒DNA进行电泳时,超螺旋质粒DNA的泳动速度比开环和线状分子的泳动速度快,所以在所提目的质粒的上方分别为线状DNA和开环DNA。质粒DNA经质量和浓度检测后,可以将完

30、整性好符合要求的质粒进行PCR或酶切等常规分子生物学实验验证。参考文献1、都艳霞，沙伟，张梅娟，等。碱裂解法提取重组质粒DNA。生物技术, Biotechnology, 编辑部邮箱 2009年 02期2、王友如，等。大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化。生物技术, Biotechnology, 编辑部邮箱 2006年 12月，第16卷第6期423、温建新; 李俊; 周顺; 任慧英; 刘文华; 邹玲; 王金宝;等。大肠杆菌质粒DNA提取方法的优选。西南农业学报, Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 编辑部邮箱 2007年 04期 4、张伟；李贵玲；齐静；张秀美等。质粒DNA提取方法优选试验。浙江农业科学。2007年第6期5、姚伟；周会；徐景升；余爱丽；张木清；陈如凯等。质粒DNA小量提取法的改进。应用与环境生物学报，2005年，11（6）；776-778。6、 生物在线7、 易生物实验技术 质粒的提取和电泳检测 17 / 17