AS染色显示细胞中多糖成分课件

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1、AS染色显示细胞中多糖成分课件糖原的显色PAS反应（periodic acid schiff reaction）AS染色显示细胞中多糖成分课件一、制片技术n生物体的组织细胞大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，需要切成薄片，必须采用各种特殊的方法对材料进行处理，把材料制成薄片标本，经过染色后，置于显微镜下观察它们的微细结构。AS染色显示细胞中多糖成分课件石蜡切片n石蜡切片法是组织学常规制片技术中应用最广泛的一种方法，是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将标本切成薄片，经一系列处理制成永久切片。n制作过程：1.取材2.固定3.洗涤4.脱水5.透明6.浸蜡7.包埋8.切片9.贴片10.脱蜡复水11

2、.染色12.脱水13.透明14.封片。AS染色显示细胞中多糖成分课件1.取材n从人或动物体内取下所需组织或器官，材料必须新鲜，组织块不宜太大，以便固定剂穿透。AS染色显示细胞中多糖成分课件2.固定n目的：迅速凝固蛋白质，终止细胞一切代谢过程，防止组织自溶，保持其活体时结构。n固定剂：10%甲醛、80%酒精、混合固定剂（Bouin氏液、FAA液、Carnoy氏液）。n用量：必须充足，一般为材料块的2030倍。n固定时间：数小时至24小时。AS染色显示细胞中多糖成分课件3.洗涤n目的：除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响后面的染色效果。n方法：多数用流水冲洗，少数用酒精。AS染色显示细胞中

3、多糖成分课件4.脱水 n目的：固定或洗涤后的组织内充满水分，而水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去，才能进行石蜡包埋。n脱水剂：酒精n方法：从低浓度到高浓度梯度酒精脱水：30%50%70%80%90%95%100%各级酒精中放置1数小时。水 酒精 石蜡AS染色显示细胞中多糖成分课件5.透明n目的：酒精与石蜡不相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。组织在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，因此该过程称透明。n透明剂：二甲苯。n方法：酒精二甲苯等量混合液（1：1）15分钟，二甲苯30分钟。水酒精二甲苯石蜡AS染色显示细胞中多糖成分课件6.浸蜡n目的：除去组织中的透明剂，使

4、石蜡渗透到组织内部，达到饱和程度以便包埋。n方法：石蜡二甲苯等量混合15分钟，石蜡、石蜡 各30分钟。浸蜡应在高于石蜡熔点3左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内（石蜡的熔点在5060之间）。AS染色显示细胞中多糖成分课件7.包埋n目的：将浸蜡后的组织块包埋于石蜡中。n方法：取出组织块，置于盛有融化石蜡的包埋框中，迅速放入冷水中冷却，待石蜡完全凝固（约30min）后取出，即做成含有组织块的蜡块标本。AS染色显示细胞中多糖成分课件8.切片 n将蜡块装在切片机上，调整所需的切片厚度（410um），进行切片，切出一片接一片的蜡带，用刀片割开蜡带。AS染色显示细胞中多糖成分课件9.贴片 n目的：借助粘附

5、剂将展平的蜡片粘附于载玻片上，以免在以后的操作步骤中脱落。n方法：在洁净的载玻片上涂抹薄层粘附剂（如多聚赖氨酸），滴两滴蒸馏水于载玻片上，把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，将载玻片放入温箱中干燥。AS染色显示细胞中多糖成分课件10.脱蜡复水 n目的：染色液多数为水溶液，因此染色前必须将组织中的蜡脱去，才能进行染色。n方法：与脱水浸蜡过程正好相反：二甲苯、30min100%酒精90%酒精80%酒精70%酒精蒸馏水 各2min。石蜡二甲苯酒精水AS染色显示细胞中多糖成分课件11.染色 n目的：使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。n经典的HE染色法：苏木精（Hematoxylin）伊红

6、（Eosin）碱性染料 酸性染料 细胞核中的DNA、RNA等 细胞质、膜性结构等嗜碱性物质（本身酸性）嗜酸性物质（本身碱性）染成蓝色 染成红色AS染色显示细胞中多糖成分课件12.脱水 13.透明 14.封片 n目的：去除水分，透明组织，便于观察和长期保存标本。n方法：脱水：95%酒精 2分钟100%酒精 2分钟 透明：二甲苯I 2分钟二甲苯II 2分钟 封片：将载玻片从二甲苯中取出放在吸水纸，迅速地在切片的中间滴一滴中性树胶，拿起盖玻片，缓慢倾斜放下，避免产生气泡。AS染色显示细胞中多糖成分课件取材固定脱水、透明浸蜡、包埋、切片、贴片AS染色显示细胞中多糖成分课件脱蜡复水染色脱水、透明封片AS

7、染色显示细胞中多糖成分课件smear stretched preparation ground section 其他制片技术涂片(smear)铺片(stretched preparation)磨片(ground section)AS染色显示细胞中多糖成分课件二、组织化学技术（histochemistry）n组织化学和细胞化学技术是应用化学反应与物理反应原理检测组织或细胞内某种化学成分，并进行定位、定量及相关功能研究的一种实验技术。n例如糖类、脂类、酶、核酸等可与试剂发生化学、物理反应，形成有色的终末产物。AS染色显示细胞中多糖成分课件 过碘酸过碘酸-Schiff反应反应（periodic ac

8、id Schiff reaction,PAS反应）反应）n原理：原理：PAS反应是经典的组织化学方法，用来显示组织细胞中的多糖或糖蛋白。原理是含有乙二醇基的糖类，在过碘酸的作用下，经氧化而产生双醛基，醛基进而与亚硫酸品红（Schiff试剂）结合，使无色液体变成紫红色染料，并沉着于含有多糖或糖蛋白的细胞或组织结构上。乙二醇乙二醇PA氧化氧化醛基醛基Schiff试剂试剂紫红色沉淀紫红色沉淀（PAS阳性反应）阳性反应）AS染色显示细胞中多糖成分课件糖原的显色糖原的显色PAS反应反应n应用：应用：可根据紫红色的位置及深浅鉴定糖成分的分布及相对含量，用于心血管疾病、糖尿病以及某些肿瘤的诊断和研究。AS染

9、色显示细胞中多糖成分课件肾小球AS染色显示细胞中多糖成分课件糖尿病肾病pas染色 AS染色显示细胞中多糖成分课件小肠上皮 AS染色显示细胞中多糖成分课件三、免疫组织化学三、免疫组织化学（immunohistochemistry）利用抗原（利用抗原（antigen,Ag），抗体（），抗体（antibody）特异）特异 结合的原理，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。结合的原理，用已知抗体检测未知抗原的一种方法。标记物为荧光素、过标记物为荧光素、过氧化物酶或金颗粒氧化物酶或金颗粒AS染色显示细胞中多糖成分课件AS染色显示细胞中多糖成分课件糖原的显色糖原的显色PAS反应反应材料：材料：n标本：成年小鼠

10、肝和脾石蜡切片n试剂：1%过碘酸，蒸馏水，亚硫酸品红溶液（Schiff试剂），0.5%偏重亚硫酸钠，苏木精，二甲苯，梯度酒精，中性树胶。n器材：染色缸，烧杯，切片架，盖玻片等。AS染色显示细胞中多糖成分课件 方法：方法：3.过碘酸氧化10分钟4.蒸馏水洗3分钟5.Schiff试剂避光染色10分钟6.0.5%偏重亚硫酸钠溶液浸洗3次（I、II、III），每次2分钟7.自来水洗3次，每次1分钟，蒸馏水洗1分钟8.苏木精染色1分30秒9.自来水洗3次，每次1分钟，蒸馏水洗1分钟10.梯度脱水：95%酒精 2分钟100%酒精 2分钟，透明：二甲苯I 2分钟二甲苯II 2分钟11.中性树胶封片，显微镜下观察（低倍镜高倍镜）*两人一小组，分别 观察肝和脾切片AS染色显示细胞中多糖成分课件注意事项：注意事项：1.从前一个缸放入后一个缸之前，要尽量沥干水。2.自来水洗涤方法：将切片架放入洗涤缸中，上下左右晃动洗涤，切不可对着自来水冲洗。3.严格控制好染色、洗涤时间。AS染色显示细胞中多糖成分课件结果判断：结果判断：n结果：糖原颗粒被Schiff试剂染色呈紫红色紫红色，细胞核被苏木精染色呈蓝色蓝色，其他背景呈淡粉淡粉红色红色。n判断：根据紫红色的颜色深浅和分布多少，判断肝、脾两份标本的PAS染色程度：，+，+，+，+AS染色显示细胞中多糖成分课件实验报告n1.实验原理n2.材料与方法n3.结果分析