非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯细胞形态学和免疫表型分析

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1、非霍奇金淋巴瘤骨髓侵犯细胞形态学和免疫表型分析李新星1 邓小娟2 彭贤贵2 (400061重庆，武警重庆总队医院检验科1；400037重庆，第三军医大学新桥医院血液科2)摘要:目的探讨骨髓细胞形态学和免疫表型在诊断非霍奇金淋巴瘤骨髓浸润中的价值。方法采用骨髓涂片和流式细胞术联合检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)骨髓侵犯。骨髓涂片经瑞氏-吉姆萨液染色,分类计数瘤细胞。骨髓NHL细胞分为4种类型：1.小细胞成熟细胞型；2.大细胞幼稚型；3.大细胞原始型；4.组织细胞型。流式细胞术采用FACS Calibur流式细胞仪， Cellquest软件荧光定量分析。每份标本分析10000个细胞。检测方案采用CD4

2、5/SSC设门，重点分析幼稚细胞群及成熟淋巴细胞群，经FSC、SSC、McAb1-FITC、McAb2-PE、CD45-Percp五参数分析，确定免疫表型。结果38例NHL分别被诊断为B细胞淋巴瘤28例、T细胞淋巴瘤7例、NK细胞淋巴瘤2例,间变性大细胞淋巴瘤1例。38例NHL细胞骨髓侵犯的骨髓细胞形态学分型结果为小细胞成熟型25例（65.8%）、大细胞幼稚型3例（7.9%）、大细胞原始型6例（15.8%）、组织细胞型4例（10.5%）。结论NHL骨髓侵犯最常见的病理类型是B淋巴细胞瘤（73.7%）。骨髓小细胞成熟细胞型NHL仅见于外周B淋巴细胞肿瘤和外周T淋巴细胞肿瘤，而以外周B淋巴细胞肿瘤

3、最为常见，占92%；小细胞的B细胞肿瘤中，以SLL为主，占52.2%。大细胞原始型的NHL细胞以T细胞和NK细胞淋巴瘤居多（66.7%）。组织细胞型的NHL细胞多见于T细胞淋巴瘤和间变大细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤少见。应用骨髓细胞形态学和流式细胞术联合检测NHL-BMI，可以提高诊断的准确性并提供相应的病理分型意见。关键词: 非霍奇金淋巴瘤；骨髓浸润；骨髓细胞形态学；免疫分型；流式细胞术Analysis of Morphology and Immunophenotype of Bone Marrow Involvement of Non-Hodgkins LymphomaLI Xin-xing

4、1 ,DENG Xiao-juan 2 ,PENG Xian-gui2(1Clinical laboratory ，Chongqing Armed police hospital ，Chongqing 400061，China；2Department of Hematology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037 , China)Abstract: Objective to research the value of morphology and immunophenotype of bo

5、ne marrow involvement（BMI） of non-Hodgkins lymphoma(NHL) . Methods combined examination of Bone marrow smear and flow cytometry（FCM）are used to detect the BMI of NHL. Bone marrow smears were stained by Wright -Giemsa staining solution and tumor cells of NHL were differentially counted under optical

6、microscope. Cells of NHL were divided into 4 types in bone marrow: 1. small mature lymphoma cells types; 2.large immature lymphoma cells types;3. large primitive lymphoma cells types;4. histiocyte types. Models of FCM is FACS Calibur and Cellquest quantitative analysis software was used. 10,000 cell

7、s were tested on each sample. detection scheme included designing CD45/SSC doors and Analyzing importantly the group of immature-cell and mature lymphocyte. The five-parameter analysis including FSC、 SSC、 McAb1-FITC、 McAb2-PE、CD45-Percp were used to determine the immunophenotype. Results 38 cases of

8、 B-cell lymphoma, 7 of T cell lymphoma , 2 of NK cell lymphoma, 1 of anaplastic 通讯作者 彭贤贵，电话： 023-68774668，E-mail：pxg1964large cell lymphoma（ALCL）were diagnosed in 38 cases of NHL with BMI. 25 cases of small mature lymphoma cells types (65.8%), 3 of large immature lymphoma cells types (7.9%), 6 of la

9、rge primitive lymphoma cells types (15.8%)and 4 of histiocyte types (10.5%) were founded by bone marrow cell morphology in all cases. Conclusion B-cell lymphoma is the most common pathologic type of NHL bone marrow involvement (73.7%). Small mature lymphoma cells types were only detected in mature B

10、-cell lymphoma and mature T -cell lymphoma, and almost in mature B-cell lymphoma（ 92%）; SLL is the most common pathologic type in small B-cell lymphoma（52.2%）.NK cell lymphoma and T cell lymphoma mostly appeared in large primitive lymphoma cells types (66.7%). The morphology of T-cell lymphoma and A

11、LCL often appeared as histiocyte types，but B-cell lymphoma rarely appeared as histiocyte types. Combination of Bone marrow cell morphology and FCM detecting the BMI of NHL could improve the diagnostic accuracy and provide views of the pathological classification.Key words: non Hodgkin lymphoma； Bone

12、 marrow involvement；Bone marrow morphology； immunophenotype ；flow cytometry（FCM）非霍奇金淋巴瘤(NHL) 是恶性淋巴细胞增殖性肿瘤,容易发生骨髓浸犯( bone marrow infiltration BMI)，后期发展为淋巴瘤细胞白血病(Lymphoma cell leukemia LMCL)。骨髓细胞形态学检查是诊断非霍奇金淋巴瘤BMI的重要手段1。NHL细胞在骨髓中其形态有高度的异质性，但由于它不同病理类型的细胞特征各不相同，要切实地把握并做出正确的诊断十分困难。我科采用骨髓细胞形态学和流式细胞术（FCM）联

13、合检测NHL细胞骨髓侵犯，现报道如下。1资料与方法1.1.病例资料我科于2010年1月至2011年2月诊断淋巴细胞肿瘤124例，结合骨髓涂片、骨髓活检、流式细胞术及FISH技术检测，确诊为ALL56例、CLL30例和NHL骨髓侵犯38例。38例NHL骨髓侵犯均为我院血液科门诊或住院患者,其中男25例,女13例;年龄580岁,平均51.8岁。1.2检验方法 1.2.1标本制备 无菌条件下行骨髓穿刺。抽吸0.3毫升骨髓液，涂7张片备用。再抽吸骨髓细胞液12毫升，肝素抗凝摇匀，置4冰箱保存, 48小时内做FCM检测。1.2.2 细胞形态学检查 细胞涂片经瑞氏-姬姆萨混合染液染色，在油镜（1000倍）

14、下分类计数500个细胞。每个病例的骨髓涂片均加做PAS和POX染色。骨髓涂片重点查找有无淋巴瘤细胞，观察细胞的异质性，包括大小、异形变、分化程度及有无成簇分布现象。判断标准按国内勇氏诊断标准：骨髓中瘤细胞数0.05时，诊断为BMI；瘤细胞数0.20时，诊断为LMCL。1.2.3 多参数流式细胞术（FCM）检测 流式细胞仪采用美国BD公司4色双激光管FACSCalibur机型， Cellquest软件荧光定量分析。每份标本分析10000个细胞，细胞在波长488nm处检测PE的红荧光和FITC的绿荧光，分别通过575nm和513nm滤光片收集，Percp的荧光通过635nm滤光片收集。采集CD45

15、/SSC设门，重点分析幼稚细胞群及成熟淋巴细胞群，经FSC、SSC、McAb1-FITC、McAb2-PE、CD45-Percp五参数分析，确定免疫表型。单克隆抗体来源荧光标记的单克隆抗体包括T、B、髓系细胞系列, 用两个系列或阶段特异性单抗加CD45进行三色荧光染色: McAb1-FITC、McAb2-PE、CD45-Percp。单克隆抗体有CD10、CD79a、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD103；CD3、CD5、CD7、CD4、CD8；CD13、CD14、CD33、MPO、CD41a、CD61、CD71；CD34、CD38、CD45、HLA-DR( human l

16、eukocyte antigen DR) 、TdT、Kappa、Lambda 等均从BD公司购买。按FCM常规方法标记表面抗原和胞内抗原。1.2.4 FCM判断NHL细胞骨髓侵犯的原则和方法首先在CD45/SSC散点图上，查找幼稚细胞群和成熟淋巴细胞群，进行设门。采用多组单克隆抗体标记细胞，分析不同系别、不同阶段的免疫标志表达情况。以CD20和CD3的表达情况，来区分瘤细胞源于B细胞系或T细胞系。B细胞含有CD10、CD34考虑为前体B；不表达CD10、CD34而表达CD22、CD23、CD25者，为外周B。T细胞表达CD7、TdT及CD34者考虑为前体T；不表达TdT及CD34而表达CD4、

17、CD8、CD5者考虑外周T。外周B淋巴细胞肿瘤中，CD5+CD10-CD23+者，考虑CLL/SLL；CD5+CD10-CD23-/+者，考虑套式淋巴瘤；CD5-CD10+CD23-或CD5+CD10-CD23-者，考虑滤泡型淋巴瘤；CD5-CD10+或CD5+CD10-，都伴CD43+者，考虑伯基特淋巴瘤；CD5-CD10-伴CD25+CD103+，考虑毛细胞白血病；CD20+CD38+CD138+者，考虑浆细胞白血病（PCL）或多发性骨髓瘤（MM）。外周T淋巴细胞肿瘤中，CD4+CD8-CD25+者，考虑成人T细胞白血病/淋巴瘤；CD4+CD8-CD56+CD3-者，考虑NK/T淋巴瘤；C

18、D4+CD8-CD30+CD56+CD3-者，考虑间变大细胞淋巴瘤； 2结果2.1淋巴瘤细胞骨髓侵犯的形态表现不同病理类型的NHL细胞,形态、大小和染色质分化程度各不相同。参考FAB关于ALL分型方法，将瘤细胞的大小与ALL-L1型和ALL-L2型划分原则等同，即L1型大小的瘤细胞为小细胞（细胞直径约612um），L2型大小的瘤细胞为大细胞（细胞直径约1225um）。将瘤细胞的大小和染色质分化程度综合判断，骨髓NHL细胞分为4种类型：1.小细胞成熟细胞型；2.大细胞幼稚型；3.大细胞原始型；4.组织细胞型。小细胞成熟型淋巴瘤细胞特征为：以小细胞为主，胞质少，易见伪足，胞质灰蓝色；核圆形或畸形，

19、染色质粗块状；核仁消失或留有核仁残迹。大细胞幼稚型瘤细胞特征为：以大细胞为主，外形不规则，可见伪足，胞质丰富，灰蓝色；核圆形或类圆形，染色质粗颗粒或小块状，付染色质区不显著；核仁不清晰或留有核仁残迹。大细胞原始型瘤细胞特征为：以大细胞为主，胞质丰富，灰蓝色；核圆形或类圆形，染色质粗颗粒状；核仁大而清晰，呈暗蓝色。组织细胞型瘤细胞特征为：胞体大小不等，差异悬殊，小者如淋巴样组织细胞，大者可为多核巨大瘤细胞。外形极不规则，易见伪足和瘤状突起，胞质多少不一，灰蓝色，A颗粒多少不定；核畸形变显著,呈凹陷、裂痕,折叠，易见双核、多核现象；染色质粗细不定；核仁大，深蓝，一到数个不等。本组病例按上述分型方法

20、，38例病例分别分型为小细胞成熟细胞型25例、大细胞幼稚型 3例、大细胞原始型6例和组织细胞型4例。2.2骨髓NHL细胞免疫表型结果分析经FCM检测，根据骨髓瘤细胞特异性抗原的表达情况，38例NHL分别被诊断B细胞淋巴瘤28例、T细胞淋巴瘤7例、NK细胞淋巴瘤2例,间变性大细胞淋巴瘤1例。在28例B细胞淋巴瘤中，SLL/CLL 12例、套细胞淋巴瘤2例（MCL）、滤泡淋巴瘤1例(FL)、边缘带淋巴瘤2例(MZL)、不能定型的外周B淋巴细胞肿瘤8例，弥漫大B细胞淋巴瘤2例(DLBCL)，前体B细胞淋巴瘤1例。在7例T细胞淋巴瘤中，前体T细胞瘤3例、外周T淋巴细胞瘤2例(PTL)，不能定型的外周T

21、淋巴细胞肿瘤2例。2.3骨髓NHL细胞形态学分型与免疫表型的关系38例NHL细胞骨髓侵犯的骨髓细胞形态学分型结果为小细胞成熟型25例（65.8%）、大细胞幼稚型3例（7.9%）、大细胞原始型6例（15.8%）、组织细胞型4例（10.5%），与免疫分型的关系见表1。表1 骨髓NHL细胞形态学分型与免疫表型的关系小细胞成熟细胞型大细胞幼稚型大细胞原始型组织细胞型SLL/CLL12套细胞淋巴瘤（MCL）2滤泡淋巴瘤(FL)1边缘带淋巴瘤(MZL)2B外周淋巴细胞瘤未能分型（BLL）611弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)11前B细胞淋巴瘤(B-LBL)1前体T细胞瘤(T-LBL)2外周T细胞瘤(PTC

22、L)21T淋巴细胞瘤未能分型(TLL)11NK细胞淋巴瘤()2间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)125（65.8%）3（7.9%）6（15.8%）4（10.5%）讨论：骨髓细胞形态学检查是诊断LBMI和LMCL最常用的手段之一，与骨髓活检相比其方法简便快捷，在诊断的敏感性和阳性率方面略低于骨髓活检2。骨髓NHL细胞的形态是多种多样的，有报道将其分为3种类型3,4，但由于没有细胞分化程度的条件，不利于临床进行准确的病理分型。本文将NHL瘤细胞分为4种类型，从分化程度和细胞大小对瘤细胞进行归类分析，意在能给临床诊断工作提供一个较为有效诊断意见。从形态学来讲，单一靠骨髓涂片检查可以检出瘤细胞，在瘤细胞数

23、量较多的情况下，可以做出LBMI或LMCL的诊断，但无法提供准确的病理分型。采用FCM技术检测出的NHL细胞的免疫表达结果，可以印证骨髓涂片的结论，同时，两种综合分析可以做出较为准确的病理分型5。从本组病例看，NHL骨髓侵犯最常见的病理类型是B淋巴细胞瘤（73.7%），T细胞淋巴瘤次之（18.4%）、NK细胞淋巴瘤少见（5.3%）,间变性大细胞淋巴瘤更少见（2.6%）。骨髓细胞形态学显示，骨髓NHL细胞以小细胞成熟细胞型为主。骨髓小细胞成熟细胞型NHL免疫表型提示仅见于外周B淋巴细胞肿瘤和外周T淋巴细胞肿瘤，而以外周B淋巴细胞肿瘤最为常见，占92%；外周T淋巴细胞肿瘤仅占8%。在23例小细胞的

24、B细胞肿瘤中，以SLL为主，占52.2%。从形态学来讲，外周B淋巴细胞瘤中除典型的CLL、HCL、浆细胞样淋巴细胞淋巴瘤和边缘绒毛状细胞淋巴瘤可以做出初步诊断外，其他如MCL、FL和MZL等都很难做出准确的判断。不过，在各个类型之间，细胞特征仍有细微的差异。本组病例经形态学和FCM结果相互印证发现，MCL在骨髓像里，通常表现出2类细胞：一是形态特征与正常小淋巴细胞极为相似，仅易见伪足和核畸形变；二是部分细胞胞体偏大且大小不一，外形不规则，易见伪足和瘤状突起，胞质量较多，细胞核大，伴畸形；染色质偏细，部分有核仁。在化疗后，骨髓像发现通常第一类细胞减少不显著，第二类细胞减少明显。这种骨髓瘤细胞在经

25、受细胞毒性药物杀伤后出现分化程度低的细胞减少，分化程度高的细胞不减的现象，可能就是MCL具备类似弥漫性大淋巴细胞淋巴瘤的侵袭性和低恶性度淋巴瘤的不可治愈性的细胞学表现6。FL细胞在骨髓表现为偏成熟的淋巴细胞，胞体略大于小淋巴细胞，染色质粗，但不呈块状或龟背状改变（与CLL区别）。MZL形态与CLL接近，但通常细胞膜外缘易见绒毛状突起。大细胞幼稚型的NHL细胞可见于BLL、TLL，形态学特征对病理分型帮助意义不明。大细胞原始型的NHL细胞可见于DLCBL、B-LBL、T-LBL和NK细胞淋巴瘤。从本组病例看T细胞和NK细胞淋巴瘤所占比例较高，共66.7%。T细胞淋巴瘤在FCM检测中胞浆CD3阳性

26、对诊断价值较高，但由于NK或NK/T淋巴瘤可能丢失多个T细胞抗原标志，因此，NK/T细胞淋巴瘤在骨髓中的诊断应综合分析。组织细胞型的NHL细胞多见于T细胞淋巴瘤和间变大细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤少见。其细胞特点在于细胞大小悬殊，外形极不规则，呈多种细胞形态改变，容易伴随浆细胞、组织细胞、吞噬细胞等反应性细胞增多，需与感染相关的噬血细胞综合征相鉴别7。应用骨髓细胞形态学和流式细胞术联合检测NHL细胞BMI，可以提高诊断的准确性并对大部分NHL BMI进行病理分型8，9。骨髓细胞形态学在对外周淋巴细胞肿瘤的诊断上，由于瘤细胞与正常淋巴细胞难以鉴别，容易漏诊，此时应用FCM技术联合检测可以帮助确定淋巴

27、细胞是否是克隆性改变。在T细胞及NK细胞淋巴瘤的诊断上，由于伴发的髓系标志较多以及大量的T细胞标志丢失，FCM诊断结果有不确定性，结合骨髓细胞形态学及细胞化学染色，可以最终明确诊断。由于NHL在细胞形态和免疫表型的多样性和复杂性，很多LBMI的诊断仅靠骨髓细胞形态学和FCM还不能做到准确的分型，需要结合淋巴结病理形态和免疫组织化学、染色体核型分析以及突变基因检测的结果进行综合分析判断10。参考文献：1 李虎生，张华.396例恶性淋巴瘤骨髓涂片分析.检验医学与临床J.2010,7(21): 2379-23802Howell S, Grey M , Chang J，et al. The value

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