交联透明质酸钠凝胶体外酶解试验 a

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1、XXXXXXXX有限公司 验证或确认文件编号XXX-QV-XX-XX-2019版本A/0交联透明质酸钠凝胶体外酶解试验页次第1页共3页1 目的 通过本验证方案来对比不同交联透明质酸钠凝胶的抗酶解能力，间接体现产品的体内保 留时间。2 范围 本方案适用于交联透明质酸钠凝胶体外酶解试验。3 人员组成及职责3.1 技术部人员：负责按照试验方案准备样品。3.2质量部QC：负责方案起草、按试验方案执行，做好检验工作，并进行记录，出具报告。4 实施时间试验时间： 样品批号：5参考文件5.1交联透明质酸钠凝胶成品检验操作规程，编号： HYMQS-304-05；5.2 YY/T 0962-2014 整形手术用

2、交联透明质酸钠凝胶6 内容6.1 概述 交联透明质酸钠凝胶在透明质酸酶的作用下发生酶解反应，成为酶解液。本实验通过检测不同透明质酸那凝胶在透明质酸酶作用下37*水浴不同时间后，酶解液中含透明质酸钠的 含量来确定交联透明质酸钠凝胶的酶解程度，以此来判断产品的抗酶解能力。6.2 仪器仪器名称型号编号电子天平FA2004X多功能酶标仪INFINITE F NAN0+XVo tex Mixer （旋涡混合器）QL-866X恒温水浴锅DK-S24X恒温水浴锅HH-4X6.3 溶液配制6.3.1透明质酸酶溶液：称取透明质酸酶1mg，加水至定容100ml,溶解即得。（透明质酸酶：供应商：博美 TH3506,

3、Sigma H3506, High Purity Grade,Lot SLBX4632, Type I-S,400-1000 U/mg）6.3.2 体积分数为0 . 1 2 5%的咔唑乙醇溶液称取0.125g咔唑，加无水乙醇100ml溶解。至深棕色瓶中，4C下贮存，有效期12个月。XXXXXXXXXXX有限公司 三级文件编号XXX-QV-XX-XX-2019版本A/0交联透明质酸钠凝胶体外酶解试验页次第2页共3页X6.3.3葡萄糖醛酸（GA）标准溶液精密称取葡萄糖醛酸对照品约0.1g,置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作 为贮备液。精密量取贮备液5.0ml，置100ml量瓶中，加水

4、制成每1ml中含50 u g的溶液，摇 匀，在4C下贮存，有效期为6个月。6.3.4 0.025mol/L 的四硼酸钠硫酸溶液称取四硼酸钠9.54g加入1L浓硫酸中，加盖。不定时振摇，直至四硼酸钠完全溶解（不 能超声溶解）。室温下贮存，有效期为 12个月。6.3.5 供试品溶液精密称定（精确到0.1mg） 0.5g交联透明质酸钠凝胶于20ml西林瓶中，加透明质酸酶溶 液2.5ml,再加水2.5ml,轧盖，置37C水浴锅水浴，按所定时间点取出，置水中煮沸15min, 放凉后过滤（注意：过滤时请保持滤膜的完整性，若滤膜破损，更换后重新过滤），从滤液 中取1ml置25ml容量瓶中，用水定容，混匀后取

5、1ml，置于编好号的试管中，按照透明质酸 钠含量检测方法检测。6.4 样品及酶解时间设置样品组和对照组分别各取6组样品（每组两个平行），分别做酶解0 h （0 h不加酶，按 照成品中透明质酸按含量测试方法95C水解后，测透明质酸钠总含量）、1h、3h、6h、9h和 24h；同时各组样品做游离透明质酸钠含量。6.5 实验方法6.5.1 按照供试品溶液制备方法，处理样品组和对照组各样品。6.5.2 按照下表制备葡萄糖醛酸标准溶液系列。试管编号012345葡萄糖醛酸标准溶液体积/ml00.20.40.60.81.0水/ml1.00.80.60.40.20葡萄糖醛酸含量/ （u g/ml）010203

6、040506.5.3 将标准系列各试管和样品试管一起置于冰水浴中，用移液器缓慢地向每管中加入0.025mol/L四硼酸钠硫酸5ml （使用之前在4C冰箱内贮存至少2h），边加边摇匀。加毕后 混匀并置沸水浴中煮沸10min后取出，冷却至室温。各试管内均加入咔唑试液0.20ml，充分 摇匀后，置沸水浴中加热15min，冷却至室温。用0号管作对照，用酶标仪测定550nm处各标XXXXXXXXXXX有限公司 三级文件编号XXX-QV-XX-XX-2019版本A/0交联透明质酸钠凝胶体外酶解试验页次第3页共3页X准管和样品管的吸光度。6.5.3 用标准管绘制吸光度 -浓度曲线，根据样品管的吸光度从标准曲

7、线上查得样品管葡萄糖醛酸含量。6.5.4 结果计算1）标准曲线试管编号012345葡萄糖醛酸含量（g/ml）吸光度曲线方程/R22）根据曲线方程及样品吸光度得出样品管中葡萄糖醛酸含量，酶解掉的交联透明质酸钠含量计算如下:样品组-1样品 编号1 h3 h6 h24 h12121212称重（g）样品吸光度样品管中葡萄糖醛酸含 量（ug/ml）样品中酶解的透明质酸 钠含量（mg/ml）样品中酶解交联透明质 酸钠含量（%）样品中保留的交联透明 质酸钠含量（%）备注：检验人/日期： 复核人/日期：6.6试验分析实验结果表明，以上样品酶解1小时，剩余交联透明质酸钠含量为；酶解3小时，剩余交联透明质酸钠含量为；酶解6小时，剩余交联透明质酸钠含量为；酶解24小时，剩余交联透明质酸钠含量为。