血小板血型系统ppt课件

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1、血小板血型系统及检测技术,华中科技大学同济医学院附属协和医院 王晓蓓,教学内容,血小板血型抗原及其抗体 血小板血型检测技术 血小板血型的临床应用 适合型血小板输注,教学目的,重点掌握：血小板输注无效 掌握：血小板血型检测技术 熟悉：血小板血型抗原及其抗体 血小板血型的临床应用 了解：适合型血小板输注,一、血小板血型抗原及其抗体,（一）血小板血型抗原,定义: 指用同种免疫抗体检测出 的血小板表面抗原 分类：血小板相关抗原 血小板特异性抗原,1. 血小板相关抗原(platelet-associated antigen),定义：血小板表面存在的与其他细胞或 组织共有的抗原 分类：红细胞血型系统相关抗

2、原(ABO等） 组织相容性抗原（HLA）,血小板上的红细胞血型抗原,存在ABO、Lewis、I和P抗原 缺失Rh、Duffy、Kell、Kidd和Lutheran系统的抗原,血小板HLA系统血型抗原,Chromosome 6,DP,DQ,DR,B,C,A,Class II,Class I,存在HLA-A和B位点的抗原 HLA-C位点的抗原 未发现HLA-DP、DQ和DR等位点抗原。但经细胞因子刺激，可产生HLA-DR抗原,2. 血小板特异性抗原,即人类血小板抗原 （human platelet antigen，HPA） 血小板特有的，其他组织细胞没有 表现血小板独特的遗传多态性 均存在于血小板

3、膜糖蛋白（GP）上,HPA的命名,1990年国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际输血协会（ISBT）血小板血清学研讨会对血小板抗原系统进行国际命名 2003年国际输血协会（ISBT）和国际血栓和止血协会（ISTH）建立的血小板命名委员会（PNC）,命名规定,在系统前冠以HPA 按发现顺序用数字编号 只有在2个对偶抗原全被检测出来后，才能被称为系统，对偶抗原按其在人群中频率由高到低，用字母命名，高的为a，低的为b 尚未发现对偶抗原的，给予暂时命名，在等位基因数字后加后缀w表示,（二）血小板抗体,产生机理：机体对血小板表面或相关抗原免疫 临床分类：血循环里的游离抗体 结合于血小板上的抗体(PA

4、IgG) 血型学分类：血小板同种抗体 自身抗体 见于：血小板输注治疗无效 同种免疫血小板减少症 自身免疫血小板减少症 药物、病毒、细菌引起的血小板减少症,血小板表面存在众多复杂抗原，因此反复大量输注血小板的患者约50%以上产生血小板同种抗体 据报道HLA抗体占多数，约80%左右 HPA抗体单独存在的频率较低（2%-3%） HPA抗体与HLA抗体共存（18%）左右 必须首先识别并去除血清中存在的HLA抗体，才能分析血小板抗体的特异性,（二）血小板抗体,鉴别有无HLA抗体存在的方法 淋巴细胞毒试验 混合淋巴细胞培养 除去血小板表面HLA抗原方法 氯喹或酸溶液在0处理血小板,二、血小板血型检测技术,

5、血清学检测 分子生物学检测,（一）血清学技术,血小板免疫荧光试验 简易致敏红细胞血小板血清学试验 单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验 改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验 流式细胞仪检测技术 微柱凝胶血小板定型试验 当HLA类抗原在血小板定型时出现强表达时，要用氯喹或酸进行预处理，去除血小板上的HLA抗原,1. 血小板免疫荧光试验(platelet immunofluorescence test, PIFT),原理,用多聚甲醛（PFA）或氯喹预处理的血小板，加入异硫氰酸荧光标记的抗血小板抗体，通过流式细胞仪或荧光显微镜检测血小板抗原抗体结合情况,临床应用,同种异体抗体与血小板的反应活性检测 血小板配

6、型,方法学评价,优点 荧光信号只评估血小板，避免了由细胞碎片引起的非特异性反应 多特异性的抗球蛋白试剂可以识别IgG、IgA和IgM抗体 最可靠的方法之一 缺点 对反应不敏感。血小板至少要结合1 000个IgG分子才能得到阳性结果,2. 简易致敏红细胞血小板血清学试验（Simplified Sensitized Erythrocyte Platelet Serology Assay, SSEPA）,原理,将血小板抗原固定在U型孔壁上，与被检血清反应后洗净，以抗IgG（或抗IgM)指示细胞反应结果 如果血小板上结合了血小板抗体，则致敏在指示细胞上的抗IgG（抗IgM）与血小板抗体结合，指示细胞向

7、孔底移动被组织，广泛覆盖在固定的血小板单层上，为阳性结果 若血小板上无抗体，则指示细胞向孔底移动不受阻，聚集在孔底中央，呈扣状，为阴性结果,阳性结果,阴性结果,结果图示,方法,直接测定法：测定血小板表面结合的血小板抗体 间接测定法：测定血清内的血小板抗体 交叉配血试验：选择配合的血小板供体,临床应用,血小板抗体鉴定 血小板血型研究 开展母婴血小板血型及多种血液病的研究 适合性血小板输注,方法学评价,简单、微量，重复性、特异性和敏感性均较理想 应用范围广，可用于检测血小板抗原抗体以及交叉配合试验；可开展大量样本的检测工作及研究工作 固相化的血小板及指示细胞能长期保存备用 不需要特殊的仪器设备，易

8、于推广,3. 单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验(Monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens assay, MAIPA),原理,在血小板上先结合人的同种抗体，然后再结合鼠抗人血小板抗体，裂解血小板后，把裂解产物移至包被的羊抗鼠IgG微孔板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG检测人的血小板同种抗体,单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验,方法学评价,优点：敏感性强。可检测出被污染的抗体、微量抗原（HPA-5）、低频率抗原。 缺点：在未知抗原检测时必须使用一组单克隆抗体，而又不能对所有糖蛋白具有活性 如果人抗体与单

9、克隆抗体和同一个抗原决定簇反应，就会引起假阴性结果,4. 改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验(Modified antigen capture ELISA, MACE),原理,血小板与抗体致敏，将形成的抗原-抗体复合物分别加入包被有抗GP Ib、GP IIb、GP IIIa、GP IX、HLA等鼠抗人单克隆抗体的微孔内，再加入酶标羊抗人IgG 底物显色，终止反应后测405nm吸光度,方法学评价及应用,优点：特异性较高 缺点：非特异的物质和某些血清中的IgG结合非常牢固 应用：对于已经去除了HPA-1a的大量标本的定型常使用竞争性ELISA技术,5. 流式细胞仪检测技术(Flow cytometry

10、, FCM),原理,免疫荧光标记技术，抗原抗体结合 同一激光光源激发得到特异荧光色 细胞体积、结构、荧光种类及性质等多种参数分析,FCM检测血小板相关抗体,6. 微柱凝胶血小板定型试验（microcolume gel test for platelet typing）,原理,向微柱凝胶中依次加入待检血清、血小板、指示红细胞 阳性结果：若待检血清中存在血小板抗体，则形成血小板-血小板抗体-抗IgG-指示红细胞四位一体的免疫复合物不能通过凝胶柱 阴性结果：若待检血清无血小板抗体，则不能形成免疫复合物，指示红细胞离心后沉于柱底,方法学评价,方法快速、敏感、操作简单 操作标准化（试剂、设备、工作程序）

11、 标本试剂用量少 结果判断客观准确 结果保存时间长（数天或数周） 安全：减少医源性传播,（二）分子生物学检测,22个HPA抗原中除HPA-14bw基因外，其它所有HPA基因多态性都表现为SNP（单核苷酸多态性），因此检测SNP的方法基本上适用于HPA基因分型 共同特点：以聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为基础，所不同的只是在于PCR引物设计以及检测PCR产物的方法,方法,PCR-SSP: 首选，最简单常用，快速经济 PCR-RFLP: 繁琐，无法对HPA-4基因分型 PCR-ASO: 繁琐，不太容易判断结果 SSCP： 不适合常规HPA检查 DNA序列

12、分析法: 操作复杂，成本较高,（三）血清学检测与分子生物学检测的关系,血清学检测 简单、快速 成本低 主要用于血小板抗体检测和交叉试验 血型抗原的血清学定型是基因分型的前提,三、血清学检测与分子生物学检测的关系,分子生物学检测 结果准确、可靠 不需要特异性抗体的血小板 基因组DNA的来源：可为尿沉淀物、口腔黏膜细胞和羊水细胞 主要用于血小板血型抗原分型,三、血小板血型的临床应用,血小板输注无效 输血后紫癜 新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜 特发性血小板减少性紫癜,（一）血小板输注无效(platelet transfusion refractoriness, PTR),1. 定义,指患者在输注合

13、适剂量的血小板后没有产生“适当的反应”，即连续两次输注足量随机供者血小板后，没有达到合适的校正血小板计数增加值（CCI），临床出血表现亦未见改善 长期依靠血小板支持治疗 这是临床输血中颇为棘手的问题,2. 原因,免疫因素（17.5%） ： HLA抗体、HPA抗体、ABO抗体、自身抗体、药物抗体、循环免疫复合物等 非免疫因素（67.5%） ：发热、败血症、脾肿大、骨髓移植、DIC、静注抗菌素等；血小板质量 非免疫+免疫因素（15%）,3. 判定指标,临床: 出血趋势不减轻，或出现输血性紫癜，出血加重 血小板计数较输注前不仅不增高，有时还会下降 校正血小板计数增加值 (corrected coun

14、t increment, CCI) CCI = (输注后血小板计数- 输注前血小板计数) 体表面积(m2) 输入血小板总数（1011L） PTR判定标准: 1 小时 CCI 7.5 109L 20-24小时 CCI 4.5 109L 血小板回收率 (percentage platelet recovery, PPR) PPR = (输注后血小板数输注前血小板数)血容量(L) 输入血小板总数2/3 PTR判定标准： 1小时 PPR30% 20-24小时PPR 20%,4. 预防措施,选用单一供者血小板（机釆血小板） 自身血小板输注 去除血小板中白细胞：WBC 5 106/L 去除血小板表面抗原：

15、用氯喹或枸橼酸解离技术去除HLA抗原 紫外线照射灭活抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）功能,5. 处理流程,首先要考虑血小板质量问题，可输注ABO 同型的非库存血小板，以排除ABO系统的抗体或血小板质量因素 若有发热、感染、DIC 等导致血小板消耗增加的因素存在，积极治疗原发病，并增加输注剂量 若有同种抗体存在，则挑选HLA、HPA 相合的供者血小板，或使用激素、免疫抑制剂或静脉注射免疫球蛋白 若病人持续输注血小板效果不佳而又找不到明确的原因，则应考虑药物性抗体的存在，停用或换用相关药物,6. 处理,供者选择：ABO和Rh相合 HLA相合 HPA相合 大量

16、静脉注射免疫球蛋白（IVIG） 血浆置换 免疫抑制剂 抗纤溶药物等,PTR的病因及处理,（二）输血后紫癜(post-transfusion purpura, PTP),1. 定义及临床表现,定义 指输注全血或血小板后引起的急性、暂时性的同种免疫性血小板减少综合征 临床表现 在输血后1周左右突然发生 皮肤瘀点、瘀斑和黏膜出血，严重者有内脏和颅内出血 大多数的患者是女性，有输血或妊娠史,2. 病因,出现血小板特异性同种抗体 常见的是抗HPA-1a 通常发生于HPA-1a阴性患者，欧美多见,3. 预防和治疗措施,血小板抗体筛选 血小板交叉配血试验，选择配合型的血小板供体输注 免疫抑制剂 血浆置换 大

17、量静脉注射免疫球蛋白,（三）新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura, NAITP),1. 定义,妊娠期间由于母婴间血小板血型不合，胎儿血小板抗原刺激母体产生血小板相关抗体，通过胎盘进入胎儿体内，导致胎儿和新生儿血小板减少 常见，病死率较高，约13%,内脏和中枢神经系统出血 脑水肿 出生时有严重而广泛的瘀点和瘀斑 出生时正常，2-3天后出现血小板显著减少,2. 临床症状,3. 实验室检查,血小板抗原的鉴定 血小板抗体的检查,治疗 患者输入母体中同种抗体无不良反应性的血小板 对患者进行换血治疗 给新生儿静脉内注射免

18、疫球蛋白 预防 随时监测母亲血清中血小板抗体 效价高时可对母亲作血浆置换治疗，降低母亲血浆中抗体的含量,4. 治疗及预防,（四）特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP),1. 定义及临床表现,定义：由于患者自身免疫系统失衡，体内产生针对自身血小板相关抗原的抗体，导致血小板大量破坏，引起免疫性血小板减少 临床表现：出血症状，多为慢性，隐匿性 女性常见,血小板相关免疫球蛋白（PAIgG）：与血小板上的相关抗原结合，PAIgG升高的水平与血小板减少的程度有关 血小板自身抗体可与自身和同种血小板结合，破坏血小板 血小板自身抗体与巨核细胞

19、结合，影响血小板的 生成,2. 发病机制,3. 治疗,血小板输注不仅没有疗效，还有可能因血小板表面各类血小板抗原的同种免疫作用，导致输血后紫癜等输血反应 应用皮质激素等免疫抑制剂 脾切除术 大量血浆置换 大剂量静脉注射免疫球蛋白 长春生物碱类药物偶联单采血小板，给难治型ITP患者输注，获得较好疗效,适合性血小板输注,（一）影响血小板输注效果的因素,与发热、感染、DIC、出血、脾肿大 血小板同种抗体 与输注量、病人血容量和一般情况有关,（二）适合型血小板输血的措施,适合型 ABO、 HLA、HPA同型输注 适合型输注措施 血小板抗体筛选 血小板交叉配合试验 HLA配合：血清学方法：淋巴细胞毒技术 PCR技术 HPA配合：血清学方法： SEPSA，微柱凝胶法等； PCR技术,安全有效输血,建立HLA、HPA已知型供者档案 适合性血小板输血：做血小板抗体检查，输注交叉配型阴性的单采血小板 滤除白细胞或除去白细胞活性的血小板,Thank you!,