叶酸检测方法研究进展

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1、叶酸检测要领研究希望1942年，Stkstad初次乐成地合成了叶酸，并阐发了叶酸的化学布局。半个世纪已往了，叶酸不停是学术界的研究热门。如今的研究证明，妇女孕前或妊娠早期缺乏叶酸是神经管畸形产生的紧张病因之一1。叶酸与同型半胱氨酸代谢干系严密，对防范心血管疾病的产生具有紧张的生物学意义2。叶酸是一组化学布局相似，生化特性相近的化合物统称，是由喋啶、对氨基苯甲酸和1个或多个谷氨酸结合而成。食品中的叶酸绝大多数是以喋酰多谷氨酸(或称多谷氨酸叶酸)的情势存在的。食品叶酸经小肠粘膜细胞内特异叶酰多谷氨酸水解酶的作用，水解为喋酰单谷氨酸(或称单谷氨酸叶酸，PteGlu)后汲取。汲取后的单谷氨酸叶酸一部门

2、又变化为多谷氨酸叶酸，在肝脏、红细胞及其他构造细胞内贮存，别的部门那么以单谷氨酸叶酸的情势漫衍于血浆、构造液、胆汁及尿液中。肝脏的叶酸浓度是血浆的几百倍，但其单谷氨酸叶酸浓度与血浆相近。叶酸以8种辅酶情势存在于生物体内，为一碳单元的载体到场嘌呤、嘧啶等紧张物质的合成。用于评价人体叶酸营养状态最常用的检测指标是红细胞叶酸及血清或血浆叶酸。如今，叶酸的检测要领已有多种，此中微生物法、同位素放射免疫法的利用最为普及。一、微生物法微生物法是检测生物体内叶酸的经典要领，通常所用的微生物有干酪样乳酸杆菌L.asEi)、粪链球菌和啤酒小球菌属。此3种微生物对差异情势叶酸的敏感度差异。粪链球菌只对非甲基化叶酸

3、敏感，如PteGlu、二氢叶酸(DHF)和四氢叶酸(THF)，可用于区分阐发种种情势叶酸在差异检测物的漫衍。L.asei对单谷氨酸叶酸、含2或3个谷氨酸叶酸(PteGlu2、PteGlu3)及其复原型衍生物均敏感，是3种微生物中反响谱带最宽的一种，也是最为常用的菌种。它对含7个谷氨酸叶酸(PteGlu7)的敏感度很小，约为对PteGlu敏感度的1，故有人以为L.asei对凌驾3个谷氨酸基团的多谷氨酸叶酸无相应。但有研究创造，L.asei对PteGlu4、PteGlu5、PteGlu6和PteGlu7的敏感度别离为对PteGlu的65.6、19.9、3.5及2.4，同时对某些情势的多谷氨酸叶酸的

4、敏感度随造就时间的延伸而增长，其机理有两种大概：其一，微生物在造就历程中合成水解酶，随造就时间延伸，水解酶产量增长，促使部门长链谷氨酸水解断裂；其二，细菌在造就历程中细胞壁对多谷氨酸叶酸的通透性增长。以是，只管L.asei对叶酸的反响谱带较宽，但如检测物中含有多谷氨酸叶酸须将样品在检测前参加多谷氨酸叶酸水解酶举行水解，使种种情势叶酸均转酿成单谷氨酸叶酸，不然检测效果不克不及代表其叶酸总含量。只管微生物法敏捷度高，效果正确，但也有很多范围性，如整个实行周期长，批间检测效果重复性差，检测效果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素身分的影响等。用-乳酰胺酶处置惩罚样品后，可消除青霉素和前锋霉素等抗生素对叶酸

5、检测效果的滋扰5。微生物法除可用于检测血清和全血叶酸外，还可用于检测纸血片叶酸6，检测效果为叶酸与血红卵白的比值。由于纸血片标本制备技能简朴，纸血片叶酸不变性较好，故该法对大范围人群叶酸营养状态的盛行病学观察具有紧张的意义。二、同位素放射免疫法只管微生物法得到种种革新，但仍因耗时大，操纵庞大而不克不及得到普及利用。70年代初，有学者提出同位素放射免疫法检测血清叶酸。该要领具有快速、轻便的特点，同时由于叶酸放射免疫试剂盒的出现，很快得到普及，尤其普及应用于临床实行室。放射免疫法与微生物法检测叶酸，除原理差异外，检测效果的意义也有所差异。对大量标本总体而言，两种要领效果相干性较好，但对个别标本，两

6、种要领效果的差异较大。微生物法对多谷氨酸叶酸相应值低，不克不及直接用于检测叶酸含量。但微生物法对全部单谷氨酸叶酸及其衍生物的反响敏捷度雷同，故在用叶酸水解酶处置惩罚样品使全部叶酸情势变化为单谷氨酸叶酸后举行检测，可得到正确的叶酸值。同位素放射免疫法对多谷氨酸叶酸反响的相对敏捷度有较大的差异，随着叶酸浓度增长，反响的相对敏捷度增长，但多谷氨酸叶酸的反响曲线不成能与单谷氨酸叶酸的反响曲线重合；另一方面，多谷氨酸叶酸与结合卵白的亲合性与单谷氨酸叶酸比拟力高，差异的单谷氨酸叶酸衍生物反响敏捷度差异，放射免疫法也不实用于检测单谷氨酸叶酸衍生混淆物。由于上述缘故原由，只管放射免疫法可用于检测和评价叶酸的营

7、养状态，但从定量检测的角度来讲，难以得到正确的叶酸含量值。如今用于检测叶酸的放射免疫试剂盒已有数种，其原理根本雷同，但差异的试剂盒检测效果也有差异7,重要区别有如下几方面：竞争结合卵白差异，或为猪血清结合卵白，或为牛奶结合卵白，或为-乳球卵白。(l)-5-甲基四氢叶酸与猪血清结合卵白的亲协力好于多谷氨酸叶酸，后者又略好于单谷氨酸叶酸的其他衍生物，而5-甲基四氢叶酸的d型异构体不克不及与猪血清结合卵白结合；牛奶结合卵白与单谷氨酸叶酸和d,l-5-甲基四氢叶酸具有雷同的亲协力，但对单谷氨酸叶酸的其他衍生物的亲协力各不雷同，对多谷氨酸叶酸的亲协力高于对其单谷氨酸叶酸衍生物；-乳球卵白那么对(d,l)

8、-四氢叶酸的结协力较差。配制尺度系列的溶液差异，重要有两种，即缓冲液和血清。用血清作配制溶液与用缓冲液作配制溶液的试剂盒比拟，检测效果偏低。放射免疫法检测叶酸效果与试剂盒选择哪一种情势叶酸作尺度品有关，如选择的尺度品为(d,l)-5-甲基四氢叶酸，那么利用此类试剂盒的条件便是假设检测物中绝大多数叶酸是以此单一辅酶情势存在的，从而使检测效果与现实含量间的偏向增大。以上所述的种种因素大概是造成如今种种试剂盒检测效果间差异较大的重要缘故原由。以是，只管种种试剂盒均有其相应的正常值参考范畴，但各实行室还应结合与叶酸营养状态有关的其他指标，来确定本实行室的红细胞或血浆、血清叶酸正常值。三、其他要领1.气

9、相色谱-质谱检测：血清或红细胞叶酸是如今用于评价叶酸营养状态的两个紧张指标，且红细胞叶酸是反响体内叶酸贮存状态的客不雅指标，对诊断叶酸缺乏具有更为紧张意义。微生物法、放射免疫法可以实现血清或血浆及溶血液叶酸含量的检测，红细胞叶酸均是通过某种数学公式，从溶血液叶酸、血清叶酸和红细胞压积等指标盘算出来的。1995年，Santhsh-Kuar等8提出用气相色谱-质谱检测的要领(G-S)检测红细胞叶酸含量，弥补了直接检测样品红细胞叶酸浓度的空缺，该要领特异性好，敏捷度高，且效果正确。2色谱阐发法:以上所述种种叶酸的检测要领，其检测效果均为单或和多谷氨酸叶酸及其衍生物混淆物的总量。纵然是微生物法也因差异

10、微生物对差异情势叶酸的生物利用率差异，无法举行某一种或某几种单谷氨酸叶酸衍生物的阐发检测。70年代，有学者提出应用色谱阐发法，包罗高效离子互换层析、离子对分派层析和高效液相色谱阐发(HPL)技能分散提取种种情势的叶酸，但由于叶酸浓度低于检测器检测下限，人们不得不在应用色谱技能分散提取叶酸后，再用微生物学检测要领举行定量检测。因该要领费时，必要样品量较大，故实在际应用受到限定。HPL-电化学检测要领对单谷氨酸叶酸及其衍生物的检测敏捷度高于紫外或荧光检测要领9，对四氢叶酸及5-甲基四氢叶酸的检测敏捷度是微生物法的1050倍。此要领可用于人类及大鼠等多种生物样品叶酸检测，且检测前无需样品浓缩处置惩罚

11、。这项技能的应用对体内叶酸汲取、代谢及转运等底子理论的研究具有紧张意义。1996年，Gunter等7创造，HPL对全血叶酸的检测效果与Bi-Rad放射免疫试剂盒对同份样品叶酸的测定效果相近，但血浆叶酸的测定效果仅为其他要领测定效果的一半，作者以为只管HPL对5-甲基四氢叶酸特异性好，但在洗脱历程中有叶酸丧失的大概。HPL技能庞大，不实用于临床通例检测。4其他要领:80年代后期90年代，有学者相继提出用非放射性标识表记标帜卵白结合技能检测血液叶酸，此中包罗克隆酶供体免疫测定法(EDIA)11、酶联配体吸附试验(ELLSA)12、化学发光受体实行等13。EDIA要领的原理在激素、地高辛及其他维生素

12、的检测中已有应用，其血清叶酸检测效果与放射免疫法相近，该要领检测速率约为放射免疫法的两倍，又无离子辐射，操纵简朴，可作为一样平常实行室通例查抄。不敷之处为用度高，约为放射免疫法的23倍。化学发光法检测重现性好，敏捷度较高，对低浓度叶酸样品检测效果显着高于其他要领7。20家研究所或临床实行室对如今用于检测血清及全血叶酸的几种要领举行了比力研究7，效果表现，血清叶酸和全血叶酸检测效果均匀变异系数别离为27.6和35.7，部门样品用差异要领检测的效果可相差29倍，表白差异实行室的叶酸检测效果差异较大，差异检测要领的检测效果之间可比性较差。这种差异倒霉于准确地客不雅地评价或人群叶酸营养状态，同时也给订

13、定逐日膳食叶酸供应量带来困难。随着叶酸在巨幼红细胞血虚、高同型半胱氨酸血症及神经管畸形的防范中的作用进一步明白，确定同一的检测要领和参照尺度，进步叶酸检测正确率的需求也日益紧急。如今美国疾病操纵中央(D)、美国国度尺度与技能研究院和美国农业部等机构已开始这方面的事情。参考文献1RVitainStudyResearhGrup.Preventinfneuraltubedefets:resultsftheedialResearhunilvitainstudy.Lanet，1991，338:131-137.3NeanE,TsaiJF.irbilgialanalysisf5-fryltetrahydrf

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15、7,66:1398-1405.7GunterE,BanBA,audillSP,etal.Resultsfaninternatinalrundrbinfrseruandhle-bldflate.linhe,1996,42:1689-1694.8Santhsh-KuarR,DeutshJ,HassellKL,etal.Quantitatinfredbldellflatesbystableistpedilutingashratgraphy-assspetretryutilizingaflateinternalstandard.AnalBihe,1995,225:1-9.12HanseSI,HlJA.petitiveenzye-linkedligandsrbentassay(ELLSA)frquantitatinfflates.AnalBihe,1988,172:160-164.