趋化因子受体CXCR4在骨髓基质细胞中的表达及分析

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1、趋化因子受体CXCR4在骨髓基质细胞中的表达及分析曹阳，吕刚，于洋，范仲凯【摘要】目的研究骨髓基质细胞的xr4表达，分析其表达规律。为改善和进步骨髓基质细胞的增殖和迁移才能寻找更有效的途径。为临床骨髓基质细胞更广泛的应用奠定基矗方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞，观察其增殖及生长特性，应用免疫组化和rt-pr方法对ss的xr4受体及xr4rna表达程度进展检测，并应用神经胶质细胞进展比照，讨论其表达异常的因素。结果骨髓基质细胞xr4rna表达程度稳定，xr4在各代骨髓基质细胞中表达小于5%，且随传代数增加而减少。结论xr4在骨髓基质细胞中表达量很少，假如促进其xr4表达将会极大增强骨髓基质细胞的

2、增殖与迁移才能。【关键词】骨髓基质细胞趋化因子受体xr4迁移abstrat:bjetivetstudytheexpressinfhekinereeptrxr4inbneesenhyalstraellsandtanalyzeitsregularity.ethdsthrughbservatinftheprliferatinandgrthharateristisftheulturedratbneesenhyalstrasteells,andappliatinfiunhistheistryandrt-prethd,testingfthexr4reeptrfssandtheexpressinlevelf

3、xr4rnaerearriedut,andglialellsereusedasthentrasttexplreitsabnralfatrsfexpressin.resultstheexpressinlevelfxr4rnainbneesenhyalstraellsasstable,xr4inthebneesenhyalstraellsfeverygeneratinaslessthan5%,andappearedtdelineithinreasefgeneratin.nlusinsssanexpressesxr4,butthepsitiveratiisveryl.ifthelevelfxr4ex

4、pressinisraised,theabilityfprliferatinandtransferillbeiprved.keyrds：bneesenhyalstraells(ss);hekinereeptrxr4;transfer骨髓基质细胞(bneesenhyalstraells,ss)是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞，具有分化成各种间叶组织细胞的潜能。骨髓基质细胞可以向骨细胞、软骨细胞、神经细胞转化。目前可以用多种方法别离、扩增，并且可以使用病毒载体进展基因层面的修饰。通过骨髓基质细胞释放各种因子可以促进血源性干细胞、神经源性干细胞、上皮细胞等的增殖。虽然体外别离ss及定向诱导是

5、ss应用的前提，但对干细胞的增殖、迁移的调控比控制分化更为重要，可以这么说：首先是有增殖、迁移，然后才有分化。这些治疗策略成功的关键骨、软骨、神经是足够的移植量。到目前为止，结果显示尽管骨髓基质细胞可以移植到这些组织，但是移植量的程度却是有限的，假如需要到达大的治疗成效那么需要更高程度、更大量的干细胞增殖和迁移到靶器官。目前研究发现干细胞趋化因子stral-derivedfatr-1(sdf-1)及其受体xr4对干细胞发动、迁移、细胞归巢起到重要作用，xr4在造血干细胞、d34+等细胞中高度表达，此过程受到微环境的调控，组织释放的趋化因子以及相关物质通过干细胞外表黏附分子以及xr4信号途径来起

6、作用，协助干细胞成功跨越内皮细胞1。虽然xr4在造血干细胞中的表达是肯定的，但在ss中表达程度尚有争论。本研究将通过动物实验对xr4在骨髓基质细胞中表达进展检测，分析影响其表达机制。1材料2培养箱(heraeus)，超净工作台(nuair)，倒置相差显微镜(lypus)，低速离心机(heraeus)，胰蛋白酶(siga)。酶标仪(bi-raddel550，bil-tik公司)、台式高速低温离心机(avantitj-30ientrifuge，bekan公司)、振荡仪(sz-100-a),37孵箱，de培养液(gib，bster)，胎牛血清(bster)，3月龄雄性sd大鼠，兔抗鼠xr4多克隆抗体

7、(bster公司)，免疫组化(sp)试剂盒(bster公司)，rnain、rnaut北京天来生物公司，rt-pr试剂盒tyb，xr4，atine引物合成sangn，兔抗鼠多克隆抗体d34，d44，d45，xr4bster。2方法2.1骨髓基质细胞别离和培养大鼠颈椎脱臼处死后，取其双侧股骨和胫骨。在超净台内剪断上下干骺端，用含10%胎牛血清的de注射器插入骨髓腔冲洗，将骨髓细胞冲入培养皿中，用de培养液冲洗，轻轻吹打，然后参加适量的de(含10%胎牛血清)，置37，5%2培养箱培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。2天后换液，以去除未贴壁的血细胞，以后每隔3天换液1次。培养细胞铺满后用

8、0.25%胰蛋白酶12消化传代。免疫组织化学方法对ss进展鉴定。2.2reverse-transriptin-plyerasehainreatin(rt-pr)检测ss中xr4rna表达培养2、3、4、5代ss和星形胶质细胞可稳定表达xr4，阳性对照，用rnain和rnaut试剂盒保存提取组织总rna。紫外分光光度计检测rna的纯度及浓度。应用pr试剂盒扩增xr4，同时扩增atin作为内参，xr4引物序列：sense(5-3)：ggttggagatatgata；antisense(5-3)：gtgtggaatggaaaa。操作程序：在反响管中制备以下反响液：rnasefreeh219l，5re

9、atinbuffer10l，2.5dntps6l，25n(a)25l，引物各2l，10u/lrnaseinihibitr2l，2.5u/lrtthdnaplyerase2l，rna2l；参加矿物油50l；设置热循环仪，按照以下程序进展反响：6030分钟，942分钟；942分钟，601.5分钟(40个循环)；607分钟；回收pr产物，使用琼脂糖凝胶电泳别离紫外灯下观察并拍照。图像分析：运用德国ftaq5501图像分析仪对rt-pr图像分析。计算条带的积分吸光度，分别采用xr4与atin积分吸光度比值表示其含量。2.3免疫组织化学检测ss中xr4表达ply-lysine玻片防脱片剂处理，取210代

10、ss细胞制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定20in，30%h221份+蒸馏水10份混合，室温510分钟。蒸馏水洗3次。滴加5%bsa封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。滴加稀释的一抗d34：1200、d44：1200、d54：1200、xr4：1100，371小时。pbs洗2分钟3次。滴加生物素化山羊抗兔igg，3720分钟。pbs洗2分钟3次。滴加试剂sab，3720分钟。pbs洗5分钟4次。使用dab显色试剂盒(ar1022)显色。蒸馏水洗涤。脱水，透明，封片。同样方法对神经胶质细胞中xr4检测进展对照。显微镜观察。ss细胞外表xr4的检测：以细胞胞浆中显示棕黄色颗粒定为阳性反响。每张涂片计数

11、100个细胞；依细胞的反响强度计分04分)，计算细胞的平均反响强度的积分值%。2.4统计学方法应用exel2022统计软件对实验数据进展统计学分析。3结果3.1原代培养骨髓基质细胞约2448h贴壁，细胞初为淋巴细胞样小圆细胞。约710d可铺满培养皿，细胞交融成单层。此时细胞为多角形、三角形或梭形，呈集落状生长。传代培养原代细胞逐渐伸展为梭形、三角形、多角形，胞体较原代略膨大，有胞浆突起，成旋涡或平行状排列。57d即可长满(图1)。ss鉴定：rss免疫组化显示d34、d45表达阴性，d44、d54表达阳性，第5代ss特异性外表标志物d44，d54表达率分别是99.5%,98.1%，(图2)。3.

12、2xr4表达免疫组化显示ss有xr4抗原表达，2代阳性率5.2%图3，以后逐渐减少、减弱，3代1.6%，4代1.1%，5代以后几乎无阳性表达图4。rt-pr检测到ss有xr4的rna表达，a为阴性对照使用正常pr扩增，但不加引物，b为dnaarker，为胶质细胞xr4表达阳性对照，d为ss的xr4表达，e为atin；各代xr4rna表达方差分析表达量和传代数无明显区别p0.05，图5。结果说明ss有xr4蛋白表达，并随传代次数增加而减少。5代后几乎不表达xr4蛋白。ss有少量xr4的rna表达，表达量和传代数无明显区别。4讨论4.11993年tashir等构建了一个b基质细胞系的dna文库，并

13、克隆出两个编码细胞因子的dna:sdf-1和sdf-1，它们与巨噬细胞炎性蛋白同属一个家族。sdf-1与il7共同作用可支持依赖基质细胞的前b细胞克隆-d34的增殖，说明它属于趋化因子x亚家族的一个成员，sdf-1的受体xr4是一个g蛋白偶联受体，nrthern分析发现，许多非造血组织和器官中均有xr4rna的表达，胸腺、脾脏和淋巴结中表达程度尤其高。sdf-1xr4轴在干祖细胞归巢中起到重要作用2。因此sdf-1xr4对干细胞的增殖和迁移的重要性越来越受到重视。近年来研究也发现xr4和配体sdf-1互相作用构成机体内一个重要的反响轴参与了某些肿瘤的抑制和进展3。4.2pittenger4等观

14、察到人ss体外培养12代仍能保持正常的染色体表型和端粒酶活性。bruder等研究说明，人骨髓ss在原代培养的初始约为500个/培养瓶，到原代培养末期能扩增到6105。传代后以这种几何级数的扩增能持续10代左右。由细胞活性分析可以看出，5代以后细胞活性开场减低，因此使用5代以前的细胞进展移植等应用效果更佳。本实验结果可以看到骨髓基质细胞表达xr4也是随着传代数增加而减少，可能和细胞活性降低有关。因此提示临床应用骨髓基质细胞治疗应选用近代细胞为佳。4.3对于ss中的xr4表达，在原代培养过程的ss就表达xr4的受体，此时ss分泌的sdf-1对于ss起作用并可以使ss进展定向迁移，这在干细胞在诸如心

15、梗或骨外伤等疾病时的ss的迁移修复作用是有重大意义的。但为什么ss表达xr4程度存在争议，可能和ss所处细胞周期有关，快速增殖的ss细胞呈现高表达xr4，同时又看到细胞xr4免疫组化和rna表达变化并不完全一致，可能是和转录后的修饰有关5，有可能是由其自身分泌的sdf-1所起作用，本研究中rt-pr与免疫组化结果存在不一致性考虑是多种原因造成的：ss也许是由两种或多种混杂的细胞快速增殖及慢速增殖细胞所表达，同时也提示目前所建立的ss培养细胞不是一种单纯的细胞系。细胞可转录xr4rna，但转录后的调控机制使其不翻译或仅翻译极低程度的蛋白，故免疫组化不能完全检测到其表达。有研究用esternblt

16、分析，数据说明有xr4受体表达，但可能是以糖基化形式存在6。4.4目前许多研究说明sdf-1xr4轴也参与了肿瘤的发生开展,并与肿瘤转移亲密相关。一些研究推断，表达xr4的肿瘤细胞转移到骨髓和淋巴结等其机制就类似于xr4造血祖细胞归巢。迄今为止，sdf-1xr4生物学轴在肿瘤转移中的作用已分别在乳腺癌、非小细胞肺癌和前列腺癌等多种肿瘤的研究中得到证实，其分子机制可能是高表达xr4的肿瘤细胞在sdf1趋化和牵引下，逆浓度梯度转移至作为配体产生源的某些器官,从而形成器官特异性的转移7,8。这同样提示xr4对于干细胞的增殖与迁移的相关作用，也使我们在应用xr4控制骨髓基质细胞的迁移的同时也应注意防止

17、变异向肿瘤方向开展的可能。4.5骨髓基质干细胞移植后，细胞迁移和增殖程度对于损伤部位是非常重要的，但是目前发现其作用是很小的。如何进步在治疗区域的细胞含量是进步临床治疗疗效的关键。stral-derivedfatr-1(sdf-1)被证明对干细胞的迁移起到重要作用，同样也是骨髓基质细胞迁移的关键因素，因此进步其配体xr4在骨髓基质细胞中的表达，将会对其增殖、迁移起到促进作用。本研究提示xr4存在于骨髓基质细胞，在细胞外表表达很少。假如可以发动细胞内部受体，增加其表达将会进步骨髓基质细胞的募集，为其临床应用提供广阔前景。【参考文献】1yszynski,rear,ratajzakj.inrprat

18、infxr4intebranelipidraftsprieshing-relatedrespnsesfheatpietiste/prgenitrellstansdf-1gradientj.bld,2022jan1，105(1):40-48.2hnn,kajiuet,seray.shrt-terulturefubilialrdbld-derivedd34ellsenhanesengraftentintnd/sidiethrughinreasedxr4expressinj.steellsdev,2022de，29:103-108.3fukunagas,aedak,ndae.assiatinbete

19、enexpressinfvasularendthelialgrthfatr,hekinereeptrxr4andlyphndeetastasisinlretalanerj.nlgy，2022jun，71:204-211.4leek,ajudark,buyanerd,etal.huanesenhyalsteellsaintaintransgeneexpressinduringexpansinanddifferentiatinj.lther，2001jun，3(6):857-866.5vnlttihaui,nthaiprdj,ehselbergera.huanadultd34-prgenitrel

20、lsfuntinallyexpressthehekinereeptrsr1,r4,r7,xr5,andr10butntxr4j.steellsdev，2022jun，14(3):329-336.6rbertf,ynn,lairea.asallprprtinfesenhyalsteellsstrnglyexpressesfuntinallyativexr4reeptrapablefprtingigratintbnearrj.bld,2022nveber,104:2643-2645.7akashit,kizuik,tsuneyaak.hekinereeptrxr4expressinandprgnsisinpatientsithetastatiprstateanerj.anersi，2022ar，99(3):539-542.8rranke,alhtraa,linaa.stral-derivedfatr-1alphainduesann-annialpathaytativatetheendrine-linkedta1geneinnn-turigenibreastellsj.jlendrinl，2022ar，40(3):113-123.