Western blot 实验步骤及其注意事项

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1、Western blot实验步骤及其注意事项一.实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）, PMSF （每克组织30p l, 10 mg/ml PMSF）, 利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4C4. 加入PMSF （每克组织30p l, 10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4C约20,000 g （约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20C保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度&取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2

2、X电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿 润和没有气泡。3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法

3、放入电泳装置中，凝胶面向阴极。4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。4膜置印迹缓冲液中于37C保温1小时。5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。7袋的一角剪一缓冲液的小口，用透析袋夹紧。8. 混合：NGS（100微升），印迹缓冲液中的抗体（10毫升），加在装薄膜的袋中，于室温下 摇动2小时（或4C过夜）9

4、. 用总体积300ml PBS-Tween缓冲液，分4次在一浅盘中洗涤薄膜，每次75ml。10. 将连接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS）加在袋内， 于室温下摇动1小时。11. 按步骤9洗涤。12. 加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS），于室温下摇动。注意事项：western blot 中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位 的抗体不能用于 western blot 检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中 的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行westernbl。t。实验中

5、取胶和膜需带手套。Western 可以参考如下步骤进行操作。1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Wes tern及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、 悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线 粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例 如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白 浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白 浓度测定

6、方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的 Western及IP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE 凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝 胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度 SDS-PAGE 的配方。(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。例如 2X 或 5X 的 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积

7、，在相 同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关 文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。100C或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。(3) 上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳 效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电 压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80T00V, 高电压可以设置在120V左右。SDS-

8、PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求， 也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE 过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90120分钟。设置定时 可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量 标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3. 转膜(Transfer)我们推荐在Wes tern实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素 膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子 夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使

9、用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为 30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定 时)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时 间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜 槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子 量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以 观察实际的转膜效果。也可以用

10、考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色, 以观察蛋白的残留情况。4. 封闭(Blocking)转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以 洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则 极易产生较高的背景。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Wes tern封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60 分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4C封闭过夜。在整个Western过程中我们推荐 使用碧云天生产的侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖蛋白膜。5. 一抗孵育(Primary antibody

11、 incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用Western 抗稀释液稀释一抗。用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢 摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4C缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Wes tern洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液 后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时 间并增加洗涤次数。6. 二抗孵育(Secondary anti body inucuba tion)参考二抗的说明书，按照适当比例用Wes tern二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标

12、记 的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4C在侧摆摇床上缓慢 摇动孵育一小时。回收二抗。加入Wes tern洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液 后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时 间并增加洗涤次数。7. 蛋白检测(Detection of proteins)参考相关说明书，使用BeyoECL, Wes tern荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。洗 片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显 影液和定影液进行手工洗片。8. 膜的重复利用(Membrane recovery)如果蛋白样品非常宝贵，可以使用 Western 一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。