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1、TUNEL 法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体 DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体 DNA 首 先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 % 的染色体DNA在Ca 2和Mg?依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被 随机切断，形成180200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-0H末 端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光 素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端， 从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端
2、转移酶介导 的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成， 很少能够被染色。低分子量的 DNA 分离后，也可使用 DNA 聚合酶进行缺口翻 译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对 完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型 的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞 和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度 远比一般的组织化学和生物化学测
3、定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛 采用。一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin） -11-dUTP在TdT酶的作 用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多 聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。 在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在 凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭 体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体 激素的交叉反应不到 1，若
4、此抗体的 Fc 部分通过蛋白酶水解的方法除去后， 则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组 织中分离的细胞凋亡测定。（一）试剂配制1、磷酸缓冲液 PBS （pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCI 200mM。2、蛋白酶 K (200|jg/ml, pH7.4)：蛋白酶 K 0.02g； PBS 100ml。3、含 2%H2O2 的 PBS 缓冲液(pH7.4)： H2O2 2.0ml； PBS 缓冲液 98.0ml。4、TdT酶缓冲液(新鲜配)：Trlzma碱3.63g用0.1N HCl调节pH至7.2，加 ddH2
5、O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29. 96g和氯化钻0.238g。5、TdT酶反应液：TdT酶32pl； TdT酶缓冲液76卩1，混匀，置于冰上备用。6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g； ddH2O 1000ml7、0.05%二氨基联苯(DAB)溶液：DAB 5mg； PBS 10ml, pH7.4,临用前过 滤后，加过氧化氢至 0.02%。& 0.5% 甲基绿(pH4.0)：甲基绿 0.5g； 0.1M 乙酸钠 100ml。9、100%丁醇， 100%、 95%、 90%、 80%和 70%乙醇，二甲苯， 10%中性甲 醛溶液，乙酸，松香水等。10、过氧
6、化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)(二) 实验步骤1 、标本预处理：(1) 石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次， 每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95%和75%乙醇各洗一次，每 次3min。用PBS洗5min加入蛋白酶K溶液(20ug / ml)，于室温水解15min， 去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min,然后按下述步骤2进行操作。(2) 冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置 10%中性甲醛中，于室温固定 10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸(2： 1) 的溶液中，于-20C处理5min,去除多余液体。
7、用PBS洗两次，每次5min,然 后按下述步骤2进行操作。(3) 培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 x 107个/ml细胞于4%中性 甲醛室温中固定10min。在载玻片上滴加50100pl细胞悬液并使之干燥。用 PBS洗两次，每次5min,然后按下述步骤2进行操作。2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5min。用PBS洗两次，每 次 5min。3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴TdT酶 缓冲液，置室温 1 5min。4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加54l TdT酶反应 液，置湿盒中于37C反应1hr（注意：阴性染色对照，加
8、不含TdT酶的反应液）。5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37C的洗涤与终止反应缓冲液，于37C 保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。6、组织切片用 PBS 洗 3 次，每次 5min 后，直接在切片上滴加两滴过氧化物 酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。7、用 PBS 洗 4 次，每次 5min。&在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05%DAB溶液，室温显色36min。9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起 放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100%正丁醇洗三次。11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记 录实验结果。（三）注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNasel部分降解的标 本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1pM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人 外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。
TUNEL法检测细胞凋亡试验原理和方法
