高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用研究

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1、优质文档学院编码：136060802学 号：0801060207吉 林 农 业 大 学 发 展 学 院毕 业 设 论 文 高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用探究学 院：生 物 食 品 学 院专 业： 中 药 学 班 级： 二 班 姓 名： 刘 俊 臣 指导教师： 刘 芳 芳 职 称： 讲 师 2010年5月31日高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用探究【摘要】高效液相色谱广泛应用在中药化学成分探究方面，在中药制剂分析中的应用也越来越深化。本文从高效液相色谱技术的类型及开展近况及其在中药制剂分析中的应用探究两个方面进展了论述，为进一步探究高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用供应理论数据。【关键

2、词】 高效液相色谱法 中药制剂分析 应用探究High performance liquid chromatography analysis of traditional Chinese medicine preparations Application Abstract High performance liquid chromatography is widely used in Chinese medicine research on the chemical constituents in traditional Chinese medicine preparation analysis

3、 of more and more in-depth. In this paper, the type of high performance liquid chromatography and Recent Developments in Chinese medicine preparation analysis of two aspects were discussed for further study of traditional Chinese medicine preparations by high performance liquid chromatography analys

4、is to provide theoretical data. Keywords: HPLC; traditional Chinese medicine preparation analysis; applied research 目 录前 言11.高效液相色谱技术的类型及开展近况22高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用探究32.1 测定中药制剂有效成分含量32.2 测定中药制剂有效部位含量32.3 在杂质检查中的应用42.4 在中药复方制剂质量测检方面的应用52.5 在中药复方制剂指纹图谱探究中的应用52.6 在中药配伍中的应用62.7 在中药复方的药动学探究中的应用6小 结8致 谢9参考文

5、献10英文原文12中文译文17优质文档前 言高效液相色谱法 (High performanliquid chromatography，简称 HPLC)是世纪 7 0年头快速开展起来的一种高效、速、高选择性、高灵敏度 的新型分别分技术，是经典液相色谱的开展 。高效液相色谱法在药物分析中的应主要鉴别相关物 质、检 查药物中有关质的含量限度 ，测定有效成分 或 主 要 成含量。高效液相色谱法是以液体作为流淌相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分别速度、并采纳颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进展分别和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，假设采纳非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流淌相，

6、即构成反相色谱分别系统。反之，那么称为正相色谱分别系统。反相色谱系统所运用的流淌相本钱较低，应用也更为广泛。中药制剂分析是以中医药理论为指导,采纳现代分析理论和方法,探究中药、中药制剂及其关联产品质量的一门综合性学科.由于中药制剂特殊是复方制剂含有有效成分多，杂质多，未知成多，含量差异大，作用特别困难，须要对其中有效成分进展分别探究。而和其他分别方法相比具有柱效高、灵敏度高，快速，重复性好，辨别率高，现已被广泛应用于中药制剂成分分别分析探究。本文综述介绍了HPLC开展近况及在中药制剂分析中的应用探究。1.高效液相色谱技术的类型及开展近况高效液相色谱法是采纳高压输液泵将规定的流淌相泵人装有填充剂

7、的色谱柱对样品进展分别测定的色谱方法，其主要类型按固定相的聚集状态包括液液色谱法(LLC)和液固色谱法(LSC)两大类。按分别机制那么包括安排色谱法(partitionchromatography)、吸附色谱法(adsorption ehtomatography)、离子交换色谱法(ion exchange chromatography；IEC)和空间排阻色谱法(steric exclusion chromatography；SEC)四类根本类型色谱法；最常见的是化学键合相色谱法及由其衍变和开展的离子抑制色谱法(ion suppression chromatography；ISC)和离子对色谱法

8、(paired ion chromatography；PIC或ion pair chromatography；IPC)；除此之外，高效液相色谱法还包括很多和分别机制有关的色谱类型，如亲合色谱法(affinity chromatophy；AC)、手性色谱法(ehiral chromatography；CC)、胶束色谱法(micellarchromatography；MC)和电色谱法(electrochromatography；EC)等 。随着色谱技术的开展，结合计算机各种软件的开发，使之HPLC和各种检测仪器联用，更加拓宽了HPLC的应用范围，如HPLCMS联用技术是以高效液相色谱为分别手段，以

9、质谱为鉴定工具的一种分别分析技术，具有高度的专属性，对多数药物的检测灵敏度超过其他分析方法，使定量测试速度显著加快，可以对混合物中的微量组分进展分析，可望成为中药探究中最具有潜力的分别检测手段。目前常用的HPLCMS联用仪具有两大分类系统，一种是从质谱的离子源角度来划分，包括电喷雾离子(electrospray ionization，ESI)，大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)和基质协助激光解吸离子化(matrix assisted laserdesorption ionization，MALDI)等；另一种是从质谱的质

10、量分析器角度来划分，包括四级杆质谱仪(quadrupoleMS，Q-MS)，离子阱质谱仪(ion MtrapMS，IT-MS)，飞行时间质谱仪(time of flightMS，TOFS)，傅立叶变换质谱仪(fourier transformMS，FTMS) ， 。液相色谱一串联质谱联用技术(LCMSMS)优点特别显著，液相色谱大大拓宽了分别范围，生物大分子也能分别，而Lc和高选择性、高灵敏度的MSMS结合，可对困难样品进展实时分析，即使在Lc难分别的状况下，只要通过MS 和MS：对目标化合物进展中性碎片扫描，那么可发觉并突出混合物中的Et标化合物，显著提高信噪比。这种分别检测技术的开展在很多

11、领域都得到应.超高效液相色谱(ultraperformanceliquidchromatography，UPLC)是液相色谱领域的新热点之一，它能够供应更加高效和快速的色谱系统。UPLC是指一种采纳小颗粒填料色谱柱(粒径小于2 wm)和超高压系统(压力大于10 kPa)的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分别度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，因此特殊适用于微量困难混合物的分别和高通量探究5 。2高效液相色谱法在中药制剂分析中的应用探究2.1 测定中药制剂有效成分含量用高效液相色谱法测定含量可以消退药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药制剂组成困难，其中不少有效成分的含

12、量测定也越来越多地采纳了高效液相色谱法。中药有效成分的测定已成为评估中药质量的重要标记，实践经历证明，HPLC的适用范围较广，可用于分析高沸点、热不稳定性、大分子量的样品，是一种特别有效和普遍适用的中药有效成分的分析方法。赵欣等6 测定当归四逆汤中阿魏酸、芍药苷、肉桂酸、甘草酸4种有效成分的含量，阿魏酸的线性为0862064 mgL (r=0999 2)，平均回收率为962 ，RSD为15 ；芍药苷的线性为20200 mgL (r=0999 3)，平均回收率为973 ，RSD为10 ；肉桂酸的线性为21273 mgL。(r=0999 5)，平均回收率为94O ，RSD为12 ；甘草酸的线性为2

13、142996 mgL (r=0999 7)，平均回收率为981 ，RSD为2O 。仪器和方法精细度均小于20。该方法能更加全面限制该方的质量，优化后的提取歪艺可为今后剂型的改良供应根底。付辉政等7 采纳HPLC法测定复方柳菊片中的蒙花苷。经方法学考察及阴性参照试验说明方法专属性强，处方中其他成分对蒙花苷的测定无干扰，且方法简便、快速、精确、重现性好。周家才等8 采纳高效液相色谱法测定连蒲双清片中盐酸小檗碱的含量，盐酸小檗碱线性范围为801272 mgL (r=0999 1，t：5)，平均回收率为9974 ，RSD=054 (n=6)。该方法精确、简便，可用于该制剂的质量限制。原文鹏9 等 采纳

14、HPLC法测定山丹酮缓释片中丹参酮类成分的含量，丹参酮I、丹参酮A、隐丹参酮和二氢丹参酮的进样量分另0 E 020200 g(r=0999 9)、030300 txg(r=0999 9)、0202O0 pg(r=0999 9)和020200 txg(r= 0999 9)范围内和各自峰面积积分值呈良好线性关系；丹参酮I、丹参酮A、隐丹参酮和二氢丹参酮的平均回收率分别为9954 、9889 、10010 、9944 ，RSD分别为040、092 、130 、153(n=6)。本法简洁、快速、精确，可用于山丹酮缓释片的质量限制。冯婉姗等10 采纳HPLC法测定滴通鼻炎水君药麻黄中的盐酸麻黄碱的含量，

15、选C18柱，流淌相为甲醇水(1：1)，流速为10 mlmin，检测波长为254 nm，该方法简便、快速、精确，各批次含量较稳定，适用于本产品的质量限制，可作为该制剂的含量测定方法。2.2 测定中药制剂有效部位含量采纳HPLC技术，建立中药有效部位分析的方法，确保中药制剂的质量和临床疗效等的探究和应用日益广泛。冯毅凡等11 建立中药复方姜附制剂中干姜有部位的含量测定方法。uV法线性范围1939mgL，相关系数r=0999 2，总酚的平均回收率为1014 ，RSD=18 (n=6)。HPLC法线性范围0220 Ixg，相关系数r=0999 9，6-姜酚的平均回收率为9857 ，RSD=031 (n

16、=6)。本探究中运用的干姜有效部位为干姜药材经超临界CO 萃取所得干姜油，建立姜附制剂中有效部位简洁管用的测定方法，该法灵敏，简便，精确和重现性好，对于姜附制剂质量限制具有重要意义。胡亚楠12 等建立脑脉通有效部位中的阿魏酸的含量测定方法，采纳大连依利特HypersilODS2Cl8色谱柱(250 mm46 mm，5Ixm)，流淌相为乙腈01磷酸溶液(15：85)，流速：10 mlmin，检测波长：316nm。结果：阿魏酸平均回收率为9912 ，RSD为208。所建立的方法简便、精确，精细度、稳定性、重复性良好，可作为有效部位的质量限制方法。李伟东13 等探究四妙勇安汤抗炎有效部位的有效成分，

17、对四妙勇安汤抗炎有效部位、各单味药以及缺味药的大孔树脂50醇洗液的HPLC图谱进展分析比拟。全方有20个峰为共有峰，通过和单昧药、缺味药色谱图的比拟，根本确认各峰的归属。结果说明，四妙勇安汤抗炎有效部位含有绿原酸、阿魏酸，咖啡酸、甘草苷和肉桂酸等成分，有效部位和金银花的相关性最大。姜华等14 建立以高效液相色谱法同时测定枳实黄酮有效部位中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的方法。采纳色谱柱为Hypersil C， (250 mm46 mm，5 txm)，流淌相为乙腈-011磷酸水溶液(20：80)，流速为10 mlmin，柱温为30 ，检测波长为283 nm。柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的进样量分别在0

18、44220 Ixgr=0999 5)、0025 60128 0 g(r=0999 3)、054270 pg(r=0999 9)范围内和各自峰面积积分值呈良好的线性关系；三者平均回收率分别为9941 、10033 、9969 ，RSD分别为114 、147 、116。本方法简便，精确、牢靠，可用于枳实的质量限制。2.3 在杂质检查中的应用历年来各国药典中收载了多种药物采纳HPLC法进展杂质检查的方法，并且可采纳HPLC法进展杂质检查的药物种类在逐年公布的药典中有所增加 ，例如在中国药典 (2005版 )其次部中就增加了142个 。随着HPLC技术的不断开展有不少国内外药物分析工作者探究和探讨了H

19、PLC法在药物的有关物质检查方面的应用，并建立了一些新方法。 HPLC 分别效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。主要用于药物中有关物质的检查。“有关物质”是指药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的构造和性质和药物相像，含量很低，只有采纳色谱的方法才能将其分别并检测。假设杂质是确定的，又有杂质的参照品，可用杂质参照品做参照进展检查。假设杂质是未知的，可以采纳主成分自身参照法或峰面积归一化法进展检查. 何笑荣等 15 应用反相高效液相色谱/二极管阵列检测RP-HPLC-PDAD技术分析中药降糖制剂中可能存在的西药成分。2.4 在中药复方制剂质量测检方面的应用中药复方

20、制剂质量限制和质量标准的制定势在必行，但由于中药复方制剂成分的困难性，给这方面的工作造成很大困难。HPLC技术在这方面有很大优势，甘草复方制剂质量评价常以甘草酸作为指标。用RP-HPLC以浅性回来法测定甘草酸的结果说明其含量随产地、药材粗细、质地、断面颜色的不同而异，断面越黄，质地硬脆，折断性大者甘草酸含量高，为评价甘草复方制剂品质供应了科学依据.16 人们由分析中药复方制剂中的一种活性组分到分析几种活性组分，渐渐提高评价中药制剂的水平。日本和台湾的安康福利部门都已明确规定，凡申请检察和注册的中药制剂必需包括至少两个做为质量指标的化学成分的含量分析。We17 等对 3种含黄芩 、葛根的中药复方

21、制剂 中的黄芩甙 、葛根素进展了测定。Lee18 以 0.03磷酸乙腈(w )为流淌相在cosmosil5C18-AR柱上用梯度洗脱同时测定了由多味药材构成的中药复方制荆中的甘草甙 、甘草甜素、橙皮甙、桂皮酸、桂皮醛、厚朴酚、和厚朴酚等 7种活性组分 。在同样的柱和流淌相条件下 ，lin19 等以对羟基苯甲酸丙酯为内标 ，测定了中药制剂中的龙胆苦甙、芒果甙 、小檗碱、黄芩甙、次黄芩素和甘草酸。2.5 在中药复方制剂指纹图谱探究中的应用 . icine preparation analysis;由于中药复方制剂成分困难，现行的各种单一测定法供应的信息量少，无法建立较完善的指纹图谱，因此有人提出建

22、立多维指纹谱尝试解决该问题。其建立既能较系统、完整地解决中药复方制剂质量限制难题，又可为中药探究中缺乏标准品的难题供应一种新的解决途径20 。马欣21 等应用 HPLC-DVD-MS2 法建立了银杏叶提取物的多维指纹图谱，同时建立了质谱总离子流(TIC) 指纹图谱，检测了银杏叶中四种有效成分 ( 黄酮和内酯类化合物 )。样品经前处理后，应用 Agilent HPLC色谱条件和 API-ES-MS 条件分析了法国、香港、山东等10个厂家样品。结果提取物的HPLC有33个峰MS 总离子流有 51 个峰。并以芦丁为参照物，计算了样品的相像度。戴德舜22，23 等在探究桂枝汤指纹图谱时采纳HPLC-M

23、S-MS 等法对其中具有双向调整作用的A局部、5 种单味药 A 局部及各单味药按收率和组方用量配比制得的 A 局部进展指纹图谱测定，并将其阐述为多维全息化学特征谱，对桂枝汤 A 局部产生双向调整作用的物质根底作了初步探讨，说明多维化学特征谱供应的大量信息可较好地反映复方及单味药物信息，所显示的各项参数如能协作必须指标的成分信息，将成为复方质量限制的有效指标，并可在必须程度上作为药效特征的有力佐证。多维指纹图谱专属性强，因为对中药中某成分有保存时间、UV 图谱、相对分子量和特征碎片 4 种信息，为中药探究中缺乏参照品提高了可能性。2.6 在中药配伍中的应用中药汤剂多为复方，每种生药又含有多种化学

24、成分。临床共煎过程中可能产生挥发、分解、助溶、吸附、水解、取代、中和、沉淀等一系列特别困难的化学物理变更，这些变更干脆影响到制剂的疗效和毒副作用。用反相高效液相色谱法测定川芎单煎剂，川芎、丹参合煎剂，川芎、当归合煎剂及改味四物汤中阿魏酸的含量时发觉各组汤剂中阿魏酸的含量差异有统计学意义，配伍熟地对阿魏酸的溶出具有助溶作用。24 吴昭晖等25 利用HPLC法探究配伍对麻黄汤中苦杏仁苷含量的影响。采纳 L8(2 7)正交设计和统计方法 (统计软件 SPSS 10 .0 0 ) ,以 HPLC法测定苦杏仁苷的含量。结果该法简便、精确、灵敏 ,复方中其他成分对测定无干扰 ,可用于麻黄汤中苦杏仁苷的含量

25、测定 ,麻黄、桂枝、甘草对方中苦杏仁苷含量的影响差异不存在显著性 ,两两交互作用差异不具有显著性。得出结论麻黄、桂枝、甘草对麻黄汤中苦杏仁苷含量影响没有显著性。杜秀芳等26 利用高效液相色谱法考察丹红注射液和10%氯化钾注射液配伍的稳定性。方法采纳高效液相色谱法HPLC梯度洗脱测定配伍液中6 h内丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B的含量。并在25时24 h测定配伍液的pH值。结果丹红注射液和10%氯化钾配伍后24 h内pH值无显著变更，丹红注射液中有效成分丹参素、原儿茶醛和丹酚酸B的含量6 h内根本稳定。结论配伍液中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B的质量和pH值根本稳定。2.7 在中药复方的药动学探究中的应

26、用 中药复方药物能表达中药配伍的整体性，发挥综合性伍用作用，是中医方剂学的传统，因此，探讨中药复方药物的药动学规律已成为探究的热点。王晓强等27 探究黄连和生地黄不同比例配伍对小檗碱在大鼠体内药动学的影响，给各组大鼠分别灌胃赐予黄连 ：生地黄为 1：0、1：1、1：4、1：8水煎剂 ，采纳 HPLC法测定大鼠体内小檗碱的血药浓度 ，血药浓度一时间数据经 DAS 20药代动力学软件分析，比拟各组大鼠体内小檗碱药代动力学参数。小檗碱在大鼠体内的代谢过程符合一级二室模型，权重 w=1C ，方差分析结果说明，4组中一样剂量的黄连配伍不同比例的生地黄，小檗碱 C、AUC 、AUC。 有显 著差异 (P5

27、The hollow fibre allowed a pH tolerance value as high as 12，therefore a pH range from 8 to 12 was examined for the acceptor solutionnle largest HPLC signal of the analytes was observed at pH 12111ere fore，in our work,donor phase pH=5 and the acceptor phase pH=12313Salt additionThe effect of saltingo

28、ut was examined by adding sodium chloride (NaCl) at a concentration between 3and 30(wv) to the donor solutionIn this experiment，increasing salt concentrations decreased extraction yields rather than enhancing themThe reason for this may be that addition of sodium chloride reduces mass transfer by ch

29、anging the Nernst diffusion layer and increasing the viscosity of the donor phaseWhich disturbs the diffusion of analytesTherefore，sodium chloride was not included in the final method314Stirring rateMagnetic stirring enhances the extraction efficiency and shortens the time to reach thermodynamic equ

30、ilibriumThis work tested the effects of several stirring rates，300，600，900，1 200 and 1 500 rmin, respectivelyThe experiments showed that the amount of analytes extracted was enhanced with increasing stirring rate until 900 rrainHowever, yields were reduced when the stirring rate，900 rmin When the st

31、irring rate was900 rminthe stability of the organic solvent was lowered and therefore the extraction efficiency was decreasedThus，a stirring rate of 900 rmin was used for all subsequent experiments32Results321Analytical performanceTo evaluate the practical applicability of the proposed LPME techniqu

32、e，linearity, precision and limit of detection of analytes were investigated under the optimized conditionsThe linearity was established with a series of working solutions prepared by diluting the stock solution with 25aqueous methanol solutionEach concentration was extracted in triplicate，and the me

33、an value of peak areas were taken for calibration Regression analysis was made with the peak area of the analytes (y) versus their concentration(c)The calibration curve equation for magnolol was y= 19544c+1191.6 (n=6)，and for honokiol was y= 18058c+26242 (n=6) The precision of the method was expressed by relative standard deviation(RSD)Limit of detection (LOD) was established at a signal-to-noise rati