文献汇报PPT(一)ppt课件

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1、Effects of short-chain acyl-CoA dehydrogenase on cardiomyocyte apoptosis,短链酰基辅酶 A 脱氢酶在心肌细胞凋亡中的作用,学生姓名：廖秀楚 专业班级：18级本临14班,TRADITON,RESULT,1,3,2,CONTENTS,CONCLUSION,01,TRADITON,方法: 一、以tBHP 刺激心肌细胞建立凋亡模型。检测细胞存活率、SCAD mNA 和蛋白表达、SCAD 活性以及游离脂肪酸含量变化。 二、采用 SCAD的最优干扰序列 siNA-1186 进行干扰，观察其对心肌细胞凋亡的影响,目的: 研究SCAD 在

2、心肌细胞凋亡中 的变化，探讨其与心肌细胞凋亡之间的关系,研究概述,采用 siNA 对 SCAD进行干扰，心肌细胞出现了明显的病理性肥大，表明SCAD 的表达失调在病理性心肌肥大中具有重要意义。然而，SCAD 在心肌细胞凋亡中的作用尚不清楚,前期研究中，采用定量蛋白质组学技术比较了 16 周龄自发性高血压大鼠和血压正常大鼠的心肌蛋白质组，首次发现 SCAD 在自发性高血压大鼠肥大心肌中的表达明显降低。进一步研究显示，在病理性心肌肥大的体内外模型中 SCAD 的表达和酶活性均显著下降,心肌是耗能最多的组织之一。正常心肌能量的60% 90% 由脂肪酸氧化提供。因此，线粒体脂肪酸 氧化对于维持心肌能量

3、代谢有重要意义,研究表明，心肌细胞凋亡是心肌肥厚向心力衰竭转化的重要机制，在肥大后期，由于心肌细胞的不断丢失，使心肌组织合胞体的功能逐渐受损，心功能逐渐降低，最终导致心力衰竭,研究背景,DCPIP：2，6-二氯酚靛酚( 2，6-dichlorophenol indophenol,SCAD：短链酰基辅酶 A 脱氢酶( short-chain acyl-CoA dehydrogenase） 酰基辅酶 A 脱氢酶家族中的一员，特异性地分解短链酰基辅酶 A 底物，是脂肪酸 氧化的第一个限速步骤，是脂肪酸氧化的关键酶。生理情况下，进入线粒体的酰基辅酶 A 在相应的脱氢酶作用下脱氢，开始脂肪酸 氧化循环，

4、从而产生大量能量，供给心肌需要,FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸( flavin adenine dinucleotide,tBHP：叔丁基过氧化氢( tert-butyl hydroperoxide,Abbreviations,PMS：硫酸甲酯吩嗪( phenazine methosulphate,1、细胞培养 2、流式细胞术 3、免疫细胞化学染色 4、MTT 比色法 5、Real-time PCR 6、Western blot（蛋白质印迹） 7、酶活性测定 8、流式细胞术,实验技术,02,RESULT,1.心肌细胞的选择,采用乳鼠心肌细胞，改良法分离,取 1 3 d SD 乳鼠心脏，0. 08%

5、 胰蛋白酶冰上冷消化 20 min 后，37 恒温水浴消化 4 min,培养心肌细胞，密度培养,将乳鼠心脏消化成为单细胞悬液，收集细胞沉淀重悬后差速贴壁 1 h 去除成纤维细胞,多次消化,接种于培养皿， 37 、5% CO2 培养箱中培养，并加入 BrdU( 0. 1mmol /L) 抑制成纤维细胞生长,取上清,心肌细胞纯度可达 95% 以上，符合实验要求,actin 抗体的免疫细胞化学染色,2. tBHP 是一种脂质过氧化物，与 H2O2 性质相似，均可用来诱导构建细胞氧化损伤模型,MTT 结果显示 tBHP 可以明显降低细胞存活率，且具有一定的浓度与时间依赖性。本研究选择 200 mol

6、/L tBHP，刺激 6 h 作为后续RNA 干扰部分的实验条件。（常采用细胞存活率为40% 60% 的处理因素来选择诱导凋亡,3-1. 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法;是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测,将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被

7、扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数,95 10 s，90 5 s，循环 50 次 95 15 s，60 1 h，65 30 s，循环 61 次,反应程序,3-2. 实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法;是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测,Real-time PCR 结果显示，随着 tBHP 处理浓度和时间的增加，

8、心肌细胞内 SCAD 的 mRNA 表达明显下降,4-1.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分,化学发光 显影，定影,4-2.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分,Western blot 的结果显示，随着 tBHP 处理浓度和时间的增加，心肌细胞内

9、SCAD 的蛋白表达均有下降,4-3.经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分,Western blot 的结果显示出与 real-timePCR结果相一致的趋势，SCAD 的蛋白表达均有下降，以浓度为 200 mol /L 作用 6 h 和 8 h 时，SCAD的表达下降更为显著( P 0. 01) 表明在心肌细胞凋亡发生的过程中 SCAD 发生了明显的变化,5-1.基于酶活性检测定量分析SCAD的活性，基于流式细胞术检测凋

10、亡细胞的百分比，进行siRNA 不同干扰序列 siRNA-1186、siRNA-744 和 siRNA-207对SCAD 的蛋白及 mRNA 表达及SCAD 活性的实验，同时设立空白对照组和阴性对照组,根据之前实验，后续的 RNA干扰实验采用 200 mol /L tBHP 作用 6 h,siRNA 不同干扰序列对SCAD基因表达进行干扰及未干扰因素对SCAD 活性检测,5-2.基于酶活性检测定量分析SCAD的活性，基于流式细胞术检测凋亡细胞的百分比，进行siRNA 不同干扰序列 siRNA-1186、siRNA-744 和 siRNA-207对SCAD 的蛋白及 mRNA 表达及SCAD 活

11、性的实验，同时设立空白对照组和阴性对照组,siRNA 不同干扰序列对SCAD基因表达进行干扰及未干扰因素对SCAD蛋白及 mRNA 表达 检测,5-3.基于酶活性检测定量分析SCAD的活性，基于流式细胞术检测凋亡细胞的百分比，进行siRNA 不同干扰序列 siRNA-1186、siRNA-744 和 siRNA-207对SCAD 的蛋白及 mRNA 表达及SCAD 活性的实验，同时设立空白对照组和阴性对照组,一、与空白对照和阴性对照组相比较 3 条干扰序列 siNA-1186、siNA-744 和 siNA-207均可不同程度地降低 SCAD 的蛋白及 mNA 表达， 其中以 siNA-118

12、6 的降低程度最明显。 二、这一趋势与 SCAD 活性检测结果的趋势一致，siNA-1186 组的 SCAD 活性相对于对照组的活性最低。因此，选择 siNA- 1186 干扰序列进行后续研究,6 -1. siRNA-1186 干扰序列通过瞬时转染对SCAD 基因表达进行干扰后，检测心肌细胞活性及凋亡率，观察趋势，并与刺激因素tBHP 诱导的心肌细胞凋亡趋势相比较,6 -2. siRNA-1186 干扰序列通过瞬时转染对SCAD 基因表达进行干扰后，检测心肌细胞活性及凋亡率，观察趋势，并与刺激因素tBHP 诱导的心肌细胞凋亡趋势相比较,心肌细胞活性、凋亡率,6 -3. siRNA-1186 干

13、扰序列通过瞬时转染对SCAD 基因表达进行干扰后，检测心肌细胞活性及凋亡率，观察趋势，并与刺激因素tBHP 诱导的心肌细胞凋亡趋势相比较,一、si RNA-1186 干扰序列通过瞬时转染对SCAD 基因表达进行干扰后，心肌细胞存活率显著降低,心肌细胞出现了明显凋亡，其程度与刺激因素tBHP 诱导的心肌细胞凋亡趋势一致。 二、这表明 SCAD在心肌细胞凋亡过程中可能具有重要作用，其表达量的降低可能是造成心肌细胞凋亡的一个重要因素,7-1. SCAD是脂肪酸氧化的关键酶，线粒体脂肪酸 氧化对于维持心肌能量代谢有重要意义,mRNA、蛋白表达、酶活性,mRNA、蛋白表达以及酶活性水平结果均显示siRN

14、A 干扰可以明显减少心肌细胞 SCAD 的表达量，降低 SCAD 的活性,7-2. SCAD是脂肪酸氧化的关键酶，线粒体脂肪酸 氧化对于维持心肌能量代谢有重要意义,游离脂肪酸含量,SCAD 下调对心肌细胞脂质代谢的影响与 tBHP 诱导心肌细胞凋亡导致的脂质变化一致,心肌细胞内游离脂肪酸含量显著增多,心肌细胞对脂肪酸的氧化能力明显降低,SCAD 的表达下调,siRNA 干扰可以减少SCAD 的表达量,7-3. SCAD是脂肪酸氧化的关键酶，线粒体脂肪酸 氧化对于维持心肌能量代谢有重要意义,SCAD 下调对心肌细胞脂质代谢的影响与 tBHP 诱导心肌细胞凋亡导致的脂质变化一致,心肌细胞内游离脂肪酸含量显著增多,心肌细胞对脂肪酸的氧化能力明显降低,SCAD 的表达下调,siRNA 干扰可以减少SCAD 的表达量,SCAD 的表达下调可能导致了心肌细胞脂肪酸 氧化能力下降，从而引起心肌细胞的游离脂肪酸含量增加，导致心肌细胞凋亡发生,03,CONCLUSION,SCAD 表达失调可能参与心肌细胞凋亡的过程，上调 SCAD 可能成为干预心肌细胞凋亡的重要环节之一,CONCLUSION,谢谢观赏，请多指点