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1、大鼠肾小球系膜细胞表型的增龄性【关键词】系膜细胞；衰老；细胞表型；p21af1/ip1/sdi1theharateristiandsignifianefratesangialellsithadvaningagedepartentfnephrlgy,kidneyinstitutekeylabfpla,hinesegeneralhspitalfpla,beijing100853,hina【keyrds】esangialells;senesene;phentype；p21af1/ip1/sdi1多数学者认为，器官衰老是由于其固有细胞功能减退所导致，肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞之一，具有调节
2、肾血流量，分泌细胞外基质、炎症介质等功能，其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。为了能客观真实地反映肾小球系膜细胞随衰老的变化，排除体外培养环境对细胞表型的影响，本研究应用自然衰老的24月龄大鼠，体外培养原代的肾小球系膜细胞，观察系膜细胞是否随机体增龄而衰老，以及老年大鼠系膜细胞p21af1/ip1/sdi1表达的变化，为进一步研究系膜细胞衰老的作用机制奠定基矗1材料与方法1.2四甲基偶氮唑盐tt法检测细胞增殖才能系膜细胞生长至80交融，0.25胰酶消化，计数后接种于96孔板，2000个细胞/孔，细胞贴壁后，继续培养24、48、72、96、120h，参加tt(5g/l)10l
3、孵育4h后，加二甲基亚矾ds200l/孔裂解细胞，避光10in，于492n波长记录吸光度值。1.6大鼠原代系膜细胞间接免疫荧光染色不同组细胞贴壁后，用3多聚甲醛2%蔗糖37固定10in，pbs洗3遍，冰上透化10in，pbs洗3遍，1牛血清白蛋白bsa冰上封闭10in，p21af1/ip1/sdi1小鼠单克隆抗体，37孵育1h，4过夜，含吐温20的tbst洗10遍，trit标记的山羊抗小鼠igg，避光室温孵育1h，tbst洗10遍，荧光显微镜下照相。1.7统计学处理使用spss11.0软件进展统计分析，计量资料使用xs表示，组间差异比拟采用单因素方差分析。2结果2.1不同月龄大鼠原代系膜细胞生
4、长及表型特征3、12及24月龄大鼠的原代系膜细胞均为长梭形或不规那么星形，贴壁后生长迅速，约34d后可传第1代。传代后，3、12月龄大鼠的系膜细胞仍保持旺盛的增殖才能，约23d传1代，3月龄大鼠系膜细胞可传20代左右；而12月龄大鼠系膜细胞可传10代以上。24月龄大鼠的系膜细胞生长速度明显较3及12月龄大鼠系膜细胞减慢，约57d才可传1代，群体倍增时间较前者系膜细胞延长1倍以上。而且传至第23代后，细胞肥大，形态变扁平、伸展，代谢减慢、生长停滞，失去增殖和传代才能。2.2不同月龄大鼠原代系膜细胞增殖才能tt法检测结果显示，24月龄大鼠系膜细胞72，96及120h的d值0.3140.05，0.3
5、850.06及0.4560.08显著低于3月龄大鼠系膜细胞0.4300.03，0.5560.04及0.6710.05及12月龄大鼠系膜细胞0.4250.04，0.5430.05及0.6570.06相应时间点的d值p0.05；3月龄与12月龄间比拟无统计学差异(p0.05)。2.5estern印迹检测原代系膜细胞p21af1/ip1/sdi1蛋白质的表达应用estern印迹，进一步检测了p21af1/ip1/sdi1的蛋白质表达程度随增龄出现的变化。结果显示与p21af1/ip1/sdi1rna的表达一致，3，12，24月龄大鼠原代系膜细胞p21af1/ip1/sdi1蛋白质的表达随增龄增加(1
6、0.04vs1.220.04vs2.030.10)p0.05。2.6不同月龄大鼠原代系膜细胞间接免疫荧光染色结果p21af1/ip1/sdi1主要在大鼠系膜细胞胞核内表达，随着年龄增长表达的荧光强度逐渐上升，3月龄组大鼠系膜细胞荧光较弱，12月龄组稍有增强，24月龄组表达非常强，各组间比拟差异有统计学意义p0.05。见图1。图1不同月龄大鼠原代系膜细胞p21af1/ip1/sdi1免疫荧光染色结果(200)略3讨论衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命。正常细胞在体外培养时，其分裂次数存在“hayflik极限，亦称最大分裂次数。这种正常细胞在体外分裂潜能受限制的现象
7、即称为复制性衰老，而这一现象提示复制性衰老可能是生物体生命周期在细胞程度的重演。有关体内细胞是否存在复制性衰老，这一问题仍有争议，但大多数生物学家认为复制性衰老与生物体整体衰老相关，是体内衰老现象的一种体外反映。随着生物体年龄的增加，衰老细胞不断在体内积聚。体外细胞培养中的复制性衰老可以反映体内衰老发生的过程，其特征包括：不可逆地丧失增殖才能，出现细胞体积增大、胞体变平，功能上发生有选择的、特异改变，例如某些衰老基因表达的变化等。p21af1/ip1/sdi1基因可能是人类可分裂细胞中控制衰老进程的主导基因之一，在衰老细胞中的表达量是增殖细胞中的1020倍，p21af1/ip1/sdi1rna
8、的增加与老化的表型及细胞增殖的丧失亲密相关。当增殖细胞的生长因子去除或接触抑制时，p21af1/ip1/sdi1基因的表达明显增加；再用血清刺激时，p21af1/ip1/sdi1rna程度在静止细胞中起初增加，随后在进入s期前降到较低程度。与此相比，衰老细胞中p21af1/ip1/sdi1rna程度并没有降低，说明该基因在维持衰老细胞表型中发挥重要作用2。众多研究皆说明，p21af1/ip1/sdi1在衰老细胞中高表达，可作为细胞衰老的特征之一3，4。而在本研究中，亦发现p21af1/ip1/sdi1在大鼠系膜细胞核内表达，且随着月龄的增加，其基因及蛋白质的表达也逐渐增强。故而，目前研究结果都说明伴随着增龄，大鼠系膜细胞确实逐渐出现了复制性衰老。综上所述，大鼠系膜细胞随机体增龄出现衰老，其细胞的表型及功能都发生了相应的改变，这可能是肾脏器官衰老的重要表达和功能减退的发生原因之一。然而，细胞及器官衰老都是多因素综合作用的结果，其过程相当复杂，故有关肾脏衰老的发活力制仍需要更多及更加深化的研究。【参考文献】
大鼠肾小球系膜细胞表型的增龄性
