绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达

《绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达（25页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、 分子生物学综合实验论文分子生物学综合实验论文 题 目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达 中国黄石 2010 年 12 月 绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFPGFP）基因的克隆与表达）基因的克隆与表达 胡丽丹 （湖北师范学院生命科学院 0803 班 湖北 黄石 43500） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物 体内的生物发光蛋白。用碱裂解法提取的的质粒 pEGFP-N3 和 pET-28 经过 BamH I 和 Not I 双酶切连接后，得到 pET-28-pEGFP-N3 重组质粒。取部分的 重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒

2、导入表达菌 E. coLi BL-21 大肠杆菌感受态细胞中。重组有 GFP 基因的 E. coLi BL-21，在含有 1 L/mL 的卡纳霉素的 LB 培养基上培养。当 A600达到 0.7 时，用终浓度为 0.8 mM 的异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养 3 小时，离心得到下层绿 蓝色沉淀物即可。 关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆 荧光蛋白 水母 CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein Gene HU Li-Dan ( Class three Grade eight, College of Life Sc

3、iences department, Hubei Normal university ,Huangshi ) Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,has been found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28 was harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline pro

4、cess extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with BamH I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28- pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist b

5、y dienzyme cutting(BamH I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21 the competent cells. E. coLi BL-21 containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 L/mL). When absorbance at 600 nm value was

6、 0.7, isopropyL -D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h. Key words: Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin 目录目录 1.1.前言：前言：.1 1.1 绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP）.1 1.1.1 GFP 研究背景.1 1.1.2 GFP 研究应用.2 1.2 基因的克隆与表达 .3 2.2

7、.实验试剂及实验仪器：实验试剂及实验仪器：.5 2.1 实验试剂与材料： .6 2.2 实验仪器： .7 3.3.实验方法实验方法.7 3.1 质粒提取方法: .7 3.2 琼脂糖凝胶电泳及回收: .9 3.3 酶切及连接： .11 3.4E. COLI DH5或E. COLI BL21 感受态制备及转入： .12 3.5 酶切验证重组质粒： .13 3.6GFP 基因的表达 .14 3.6.1 活化菌种.14 3.6.2 扩大培养.14 3.6.3 IPTG 诱导 GFP 基因的表达.14 4.4.结果与分析结果与分析.14 4.1 质粒提取过程中现象与结果： .14 4.2 琼脂糖凝胶电泳

8、 .15 4.3E. COLI DH5或E. COLI BL21 感受态制备及转入结果 ： .16 4.4 酶切验证重组质粒 .16 4.5 GFP 基因的表达结果：.17 5.5.讨论：讨论：.18 5.1 提取质粒出现图六的原因是： .18 5.2 琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： .18 5.3 E. COLI DH5或E. COLI BL21 感受态制备及转入出现图九、十原因: .19 5.4 酶切验证重组质粒出现图十一原因： .19 5.5 GFP 基因的表达结果如图十二、十三原因：.19 6.6.参考文献参考文献.20 前言： 1.1 绿色荧光蛋白（green fluoresce

9、nt protein，GFP） 1.1.1 GFP 研究背景 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的 生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光1。日本科 学家下村修 1962 年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白, 如图一所示。 这种蛋白在紫外线光中呈现绿色, 这种水母 体内含有一种生物发光蛋白质 aequorin，但它本身发蓝光,通过对光谱的研 究, 下村修提出了发光景水母所发的绿光是 因激发的水母素向绿色荧光蛋白 发生的荧光能量转移所致。即水母素作为 一种能量供体, 而绿色荧光蛋白成为能量 受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的 应用, 但水母素是荧

10、光酶的一种, 它需要有荧光素底物, 经过酶促反应后发光。 GFP 能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜 色。其在阳光下呈绿色、 钨丝下呈黄色、 紫外光下呈现强烈绿色2。 1987 年，道格拉斯普莱沙（Douglas Prasher）克隆出了 GFP 的基因序列。 1993 年，在普莱沙的基础上，马丁沙尔菲（Martin Chalfie）成功地通过基因重 组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生 GFP，这不仅 证实了 GFP 与活体生物的相容性，还建立了利用 GFP 研究基因表达的基本方 法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研

11、究的一 场“绿色革命”揭开了序幕。 此后，谢尔盖路基亚诺夫（Sergey A. Lukyanov）又从一种珊瑚中分离出 了与绿荧光蛋白类似，但能发出红色光的荧光蛋白，预示着荧光蛋白可以有不 同的颜色。美籍华人钱永健（Roger Y. Tsien）系统地研究了绿荧光蛋白的工作 原理， 。钱永健还对绿色荧光蛋白进行了颜色突变。不同颜色可以同时在同一个 图一：夜晚水母体内 GFP 显色4 Figure1 Chromogenic GFP in Fellyfish at night4 细胞或组织内标记多种蛋白或结构。多种颜色的绿色荧光蛋白的出现, 为研究 蛋白之间的相互作用、蛋白分解等提供了无限的可能性

12、。现在世界各地实验室 使用的 GFP , 都是经过改造优化了的, 而钱永健是这方面的先驱和领先人物2。 1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构， 如图二. 长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中心 螺旋的反平行 折叠组成， 荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖， 底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。 发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-GLy 自身环化和氧化形成2。 图二：GFP 晶体结构 图三: 质粒 pEGFP-N35 Figure2 Crystal

13、structure of GFP Figure3 pEGFP-N35 2001 年 1 月 11 日，美国科学家宣布培育成世界上首只转基因猴, 这是世界 上首次培育成功转基因灵长类动物. 添加在这只名为安迪的猴子体内的就是这 种标志基因。 1.1.2 GFP 研究应用研究应用 在生物学研究中，科学家们更多的是利用这种能自己发光的荧光分子来作 为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原 来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明 的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。 但传统的荧光标记在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导至被观 察

14、的细胞死亡，这叫做“光毒性”。因此，在 GFP 发现以前，科学家们只能通过 荧光标记来研究死亡细胞静态结构。相反，绿色荧光蛋白对生物体无毒无害, 分子量小, 方便构建载体, 同时在多种非水母的生物体中均可稳定表达并易于检 测, 所以, 作为一种生物分子标记, 具有广泛的应用前景 3。由于 GFP 荧光是生 物细胞的自主功能, 是一种现成的荧光蛋白质，荧光的产生不需要任何外源反 应底物,因此 GFP 作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报 告蛋白无法比拟的。 本实验是利用实验室提供的质粒 pEGFP-N3,其结构如图三所示.其上有 所用酶的酶切位点。 1.2 基因的克隆与表达 基

15、因克隆（分子克隆 molecular cloning）-通过体外重组技术,将一段目的 DNA 经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的 过程。如下图四所示: 所需元件:限制性内切酶: BamH I 和 Not I（BamH I 的切点为： 5-GGACC-3 Not I 的切点为 5-GCGGCCGC-3 3-CCTAGG-5 3-CGCCGGCG-5 载体: E. coLi DH5a（1.易于接纳外源 DNA。 2.无特异的内源性核酸内切酶 3. 载体复制、扩增不受阻 4.与质粒有互补性) 受体细胞: E. coLi BL-21（1.易于接纳外源 DNA。 2.无特异

16、的内源性核酸内切 酶 3.载体复制、扩增不受阻 4.与载体有互补性） 目的基因: pEGFP-N3 选择标记基因：pET-28（同时含有抗 kana 的基因有助于后面选择，和 -半乳 糖苷酶基因可被异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的基因 GFP） 连接：平末端连接（相同酶切产生互补的粘性末端，再通过碱基互补配对连接） 原核基因表达系统（Gene Expression）： 由于目前对原核生物基因结构了解的要透彻一些，所以一般将目的基因导入到 原核生物中。将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速 高效地表达、合成基因产物的体系。如图五所示。 为提高 GFP 表达的效率

17、，我们一般可从以下三个方面考虑： 1.基因水平上:尽量选用受体细菌细胞的偏爱性密码子6 2.载体水平上:通过核外质粒构建合适的操纵子、增强子6,如本实验的 -半乳糖 苷酶操纵子基因,故通过异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达目的基因 GFP 表达 3.作为受体细胞上:根据 DH5a 和 E. coLi BL-21 结构特点不同,前者对外援质粒扩 增阻碍作用很小,故作为克隆菌;后者易于外源基因表达,故选用表达菌。 图四：基因克隆的过程 Figure4 Process of gene cloning 本实验是应用已学过的分子知识和查阅一些参考文献，来设计老师给定的 实验课题。第一，是学习运

18、用科学理论知识指导设计实验使用方法；第二，学 习科学严谨的实验操作；第三，查阅文献了解并学习了绿色荧光蛋白基因 （GFP）相关特性和研究进展，巩固理论知识的同时也开拓了我们的视野。 本实验我们做了以下工作：将绿色荧光蛋白基因（GFP）插入 pET-28 构 建 pET-28- pEGFP-N3 重组质粒，将重组质粒导入 E. coLi DH5 扩增，用碱法 提取质粒。核酸电泳检测质粒是否成功导入大肠杆菌，再酶切鉴定所提取质粒 是否为重组质粒。将提取的质粒导入 E. coLi BL-21 感受态中，经 IPTG 诱导目 的基因表达产生绿色荧光蛋白（Green fluorescent protei

19、n,GFP ） 。 本试验通过做实验过程中，王老师细心地指导及斧正以及同组同学的协商 配合，最终实验结果大抵让人满意。在表达菌 E. coLi BL-21 中表达了我们期望 的结果绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP ） 。但此试验在 LB 培 养基平板上生长效果不是很好，酶切效果也不是那样完美，在以后的实验设计 中要进一步完善这两部分的工作。 2.实验试剂及实验仪器： 图五：基因克隆与表达 Figure5 Gene cloning Bam HI 识别 GGATCC; Not I 识 别 GCGGCCGC） ；而另一些识别不连续的序列（如 BgL I 识别

20、GCCNNNNNGGC） 。限制性内切酶酶 切 DNA 后形成两种类型的末端：(i)两条链断裂的位 置是交错地，产生粘性末端，如 EcoR I 酶切后产生末 端；(ii)两条链的断裂位置处在一个对称结构 的中心，产生平末端，如 Hae III 酶切后产生 DNA 连接酶能够催化在两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条 DNA 链的 3-末端具有一个游离的羟基（-OH） ，和在另一条 DNA 链的 5-末端 具有一个磷酸基团 （-P） 。 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-GGCC-3 3-CCGG-5 。 Ligase 5 35 3 反应体系选平衡液，依据查阅内切酶

21、供应商在目录后的附录中提供的各种酶在 不同 buffer 中的活力表，如果有一种 buffer 能同时使 2 种酶的活力都超过 70% 的话，就可以用这种 buffer 作为反应 buffer。对于本实验所用的酶为 BamH I 和 Not I 在 bufferH 均有最高酶活性。 具体操作步骤： 按如下双酶切体系（30 L）混合 ： 反应物（L）pEGFP-N3 pET-28a 质粒 1818 BamH I 2 2 Not I 2 2 10bufferH3 3 0.1%BSA 缓冲液 3 3 1.离心 10s，混匀。 2.37水浴酶切 3h。 3.配制 1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶 30

22、mL。 4.适当放置冷却，45左右倒于电泳胶板上，插好梳子。 5.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。 6.酶切样品中加入 5 L 溴酚蓝-GeneFinder 混合液混匀，上样。 7.在 1TAE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳 30min 8.回收连接好的目的基因，依次加入 5 L 回收纯化的 pET-28a 质粒,GFP 基因片 段 12 L，T4 连接酶 1L，缓冲液（10）2 L 3.4E. coLi DH5 或 E. coLi BL21 感受态制备及转入： 实验原理:感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞 才能稳定摄取外来的 DNA 分子。受体细胞经过一

23、些特殊方法（如：电击法， CaCL2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有 外源 DNA 的载体分子进入的感受态细胞。 目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCL2 法，简便易行，且其转化效率完 全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体 积 15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此 CaCL2法为使用更广泛。 将正在生长的大肠杆菌细胞在 0下加入到低渗的 CaCL2溶液中，便会使 细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量 制备感受态细胞，其转化效率可达到 5106-2107个转化克隆子/g 超螺旋质粒 DNA。制备好

24、的大肠杆菌感受态细胞可在-70冻存。 在 0下外源 DNA 可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42， 90s）诱导细胞吸收 DNA。 转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37培养1h，可使质粒DNA 中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞 可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。 具体实验操作步骤： 用枪头挑一大肠杆菌E.coLi DH5或BL21单菌落放入2 mL LB液体培养基（含 Kana 1 L/mL），37 培养过夜。 （1） 活化大肠杆菌：取4mL新鲜的LB液体培养基加入80 L的过夜菌，培养3 个小时。 （2） 将昨夜

25、摇出来的E.coLi DH5或BL21培养液转入离心管中,冰上放置10min,然 后于4 下4000rpm离心5min。 （3） 弃去上清,用预冷的0.1mol/L 的CaCL2溶液600L轻轻悬浮细胞,冰上放置 20 min, 4下4000rpm离心5min。 （4） 弃去上清,加入300 L预冷的0.1mol/L的CaCL2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放 置5min,即成感受态细胞悬液，可-80长期保存。 （6） 取2个无菌离心管，分别加入100 LDH5感受态细胞悬液，第1管加5 L 无菌水，第2管加入质粒DNA溶液5 L,轻轻摇匀,冰上放置30min。 （7） 42水浴中热激90s,热激

26、后迅速置于冰上冷却5min。 （8） 分别向管中加入400 L LB液体培养基,混匀后在37振荡培养60min。 （9） 从管1中取100 L涂布于含抗生素,从管2中取100 L涂布于含抗生素的 平板上。正面向上放置约10分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿, 37培养14小时。 3.5 酶切验证重组质粒： 原理：经同种酶切后（BamH I 和 Not I） ，重组质粒从新被切开，经琼脂糖凝胶 电泳后，在紫外分析仪下看其跑过的胶图，进行分析。 实验步骤： 按如下双酶切体系（20 L）混合 ： 提取 E.coLi DH5 中的重组质粒，在下列体系下反应 反应物（L）pET-28-pEGFP-

27、N3 质粒8 BamH I500 Not I500 10bufferH2000 0.1%BSA 缓冲液3 Triox-100(0.1%) 1 BSA(0.1%) 1 ddH2O6 水浴 2h 后，经过琼脂糖凝胶电泳。 3.6GFP 基因的表达 3.6.1 活化菌种 用黄色枪头蘸取表达菌 E.coLi BL21 种单菌落，连同枪头一起垂直放入装有 2 mL 的 LB 液体培养基的试管（含有卡那青霉素，其工作浓度为 1L /mL）中。 于 37 摇床振荡培养 14 小时。 3.6.2 扩大培养 将试管中活化的 80L 菌液接种到 4 mL LB 培养基，同时加入卡那青霉素（终 浓度 1L /mL）

28、培养基于 37 恒温培养箱中培养 3 小时。 3.6.3 IPTG 诱导 GFP 基因的表达 实验中在不同的培养时间（用 OD 值表征菌体密度）加入 IPTG 诱导表达发现， 当 OD=0.8 时，加的 IPTG 至终浓度为 0.8mM 时 GFP 的表达量达到最大 4.结果与分析 4.1 质粒提取过程中现象与结果： 阶段溶 液 I溶 液溶 液:氯 仿 现 象 EP 管中溶 液为混浊 液。 EP 管中出 现上层变 澄清，下 层沉淀 EP 管中溶 液溶液有 絮状物产 生 加入氯仿 离心后溶 液分层 图表六 3-1 碱法提质粒过程中的现象 Figure6 sodium dodecylsulfate

29、(SDS) alkaline process extraction 结果分析: 加入溶液的作用是维持细胞渗透压，使细胞悬浮在溶液中，故呈现浑浊；加 入溶液作用使细胞裂解，释放内涵物，内含物溶于溶液，故上层变澄清； 加入溶液作用是时变性的质粒在酸盐环境下从新复性，但大量基因组 DNA 不能复性，在 PDS 作用下产生絮状沉淀。 加入氯仿破坏了蛋白质，使其变性沉淀。 4.2 琼脂糖凝胶电泳 如图七所示电泳结果图可以看到，第一孔道和第九孔道跑的带在紫外分析仪 下,明显跑带量少,效果不如其余七条带。中间几条带总共出现五条带如图八，条 带 1 最为明亮，说明第一条带出所含的核酸物质最多。大肠杆菌中 RN

30、A 的拷 贝数远大于质粒 DNA 的拷贝数，而核酸电泳分析过程的实验操作过程中没有 加入 RNase 降解所制样品中含有较多的 RNA，所以判断该条带一定为 RNA。 提取的质粒多数以超螺旋型存在，超螺旋的质粒 DNA 中一个螺旋由 10 个碱基 组成，当分子上有一个缺刻时，分子会立即松弛，形成开环分子。如果质粒的 双链配对处都断裂则形成线性质粒。分子量相同的情况下，可以判定：条带 2 为超螺旋 DNA，条带 3 为线性 DNA，条带 4 为开环 DNA，条带 5 可能为线性 DNA，超螺旋 DNA，开环 DNA 中的两者或是三者缠在一起未得到分离。 图七：琼脂糖凝胶电泳九条孔道电泳 Figu

31、re7 All channels in Agarose Gel El ectrophoresis 图八：琼脂糖凝胶电泳中间七条孔道 电泳图 Figure8 Seven channels amid Agarose Gel Electrophoresis 4.3E. coLi DH5 或 E. coLi BL21 感受态制备及转入结果 ： 管 1 中取 100 L 无菌水涂布于含抗生素 LB 平板结果如图九为：LB 平板未生 长任何菌落;管 2 中取 100 L 重组质粒涂布于含抗生素的平板上结果如图十为： 生长少量菌落; 分析：管 1 做空白对照，表明在含抗生素的培养基上无法生存任何自然条件菌

32、落； 管 2 实验组，表明重组质粒能表达某种蛋白物质，使重组均在此环境能生存。 图九：空白对照管 1 Figure 9 Negative contrast 图十：实验组管 2 Figure 10 Experimental group 4.4 酶切验证重组质粒 如图十一所示所有孔道，其中第七八孔道是浓度不同的 Maker 蛋白。其余九条 孔道为实验酶切的带。两条 Maker 蛋白明显可见六条带，而实验组的带型都很 模糊。已知 pEGFP-N3 的分子量为 4700bp,而 pET-28a 分子量为 5369 bp，故在 相同的构型下，pEGFP-N3 应比 pET-28a 跑的快一些。图中所示的

33、六条带，有 上述原理可以判断为：条带 1 pEGFP-N3 超螺旋 DNA，条带 6pET-28 开环 DNA，剩下带 2、3、4、5 难以准确判断，但线性 pEGFP-N3 肯定在环形 pEGFP-N3 之前，超螺旋 pET-28 也肯定在线性 pET-28 之前的。 图十一：酶切验证质粒 Figure11 Validate plasmid via enzyme-cutting 4.5 GFP 基因的表达结果： 加入 IPTG 诱导后，可观察到菌体细胞呈现绿色如图十二所示，说明目的 基因在表达菌 E. coLi BL21 中表达。如图十三所示在紫外光下可以观察到菌体 细胞发绿色荧光。 图十二

34、：GFP 基因在表达菌内表 达 Figure12 GFP gene expression in E. coLi BL21 图十三：GFP 在紫外光照射下 Figure13 GFP exhibites green fluorescent under ultraviolet light 5.讨论： 5.1 提取质粒出现图六的原因是： 1.加入溶液的作用是制备菌悬液，加入葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆 菌不会快速沉积到管子的底部，所以观察到得溶液呈乳白浑浊状； 2.加入溶液的作用是使细胞破裂，蛋白质和细胞壁沉淀，质粒溶出， NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，它使细胞膜发生了从 biLayer（双层膜

35、） 结构向 miceLLe（微囊）结构的相变化导致细胞溶解，因此观察到有大量 白色絮状沉淀； 3.加入溶液的作用是使大肠杆菌基因组 DNA 沉淀，SDS 遇到钾离子后变成 PDS，而 PDS 是水不溶的，基因组 DNA 较长因此发生了沉淀，因此观察 溶液较为澄清； 4.氯仿为有机溶剂可以使蛋白质变性，进一步除去初提质粒中的蛋白质沉淀， 氯仿不溶于水，所以观察到分层现象 5.2 琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： 1.核酸电泳图谱中凝胶的最前端条带较亮，说明该处有较多的核酸物质，而 在质粒提取分析过程的实验操作过程中没有加入 RNase 降解所制样品中含 有较多的 RNA（由 E. coLi D

36、H5a 转录产生） ，所以判断该条带一定为 RNA，但是由于电泳的时间不够，导致不同大小的 RNA 未分开。 2.第一孔道和第九孔道条带没有其他孔道的核酸物质得多，条带不明显。分 析可能的原因是，第一孔道最先上样，而总共有九个道操作时间过长导致 开始电泳时孔道中的样品已经发生扩散，所以导致电泳时条带不明显，而 第九孔道上样是样品还未来得及在重力作用下进入孔道，电源就一接通， 致使部分质粒样品在缓冲液分子的作用下，扩散到缓冲液中，所以导致电 泳时条带不明显 3.第一孔道由于样品时间放置过长后扩散，仅仅观察 1 条带，且为条带 2，为 超螺旋型质粒，因为一般提取的超螺旋质粒占总量的 70%以上，所

37、以在样 品量较少的情况下仅可观察到超螺旋质粒条带。第九孔道由于样品还未进 孔道，在缓冲液的作用下，可观察到条带 4、5，可能为环形或是混合构型 的质粒，已知相同环境下，超螺旋型质粒和环形质粒运动的阻力要小一些， 故很容易在电源接通条件下被扩散出去，所以观察到仅为条带 4、5 5.3 E. coLi DH5 或 E. coLi BL21 感受态制备及转入出现图九、十原因: 管 1 中取 100 L 无菌水涂布于含抗生素平板未长菌的原因是：抗生素 kana 能 够抑制自然条件下一般细菌的生长,结果未长菌正好对照管 2 长菌是目地菌。 从管 2 中取 100 L 涂布于含抗生素的平板上长少量菌的原因

38、可能是： 1.目地基因在表达菌 EcoLi BL21 中得到，故其能在抗生素 kana 平板上生长 2.少量菌的原因为感受态制备过程中，由于时间和温度把握不充分，一些重组 质粒未进入细胞中，故细菌未得到重组质粒，或是部分质粒被 E. coLi BL21 体 内的酶机制降解了，故都无法在目地菌中表达抗 Kana 的蛋白故无法生长。 3.在加入氯仿后，按照预计现象应该是透明的水层在上，浑浊稠密的有机层在 下方，且目的质粒在上层中。但实际操作中可能由于氯仿的比重或是溶液放置 时间过长，致使有机层密度小于水层，故质粒分布在上层有机层中。但我们组 操作时因不慎震动摇晃了。 5.4 酶切验证重组质粒出现图

39、十一原因： 实验组的九条孔道跑带都不清晰的原因可能是： 1.用于酶切的重组质粒 DNA 含量太少或者是浓度低，所以没有 maker 蛋白显 带那么亮。 2.电泳时间太短，致使已经酶切分离的质粒，在实验时间内还未来得及分开。 3.提取的质粒含有一些杂质，而这些杂质可以堵塞孔道，致使质粒无法在电 泳胶上顺利跑开，所以看到的质粒未分开。 4.水浴酶切反应时间不足，质粒还没在酶的作用下充分反应，故看到的重组 质粒没切开。 5.5 GFP 基因的表达结果如图十二、十三原因： 重组质粒 pET-28a-pEGFP-N3 在 IPTG 的诱导下，GFP 基因没有物种特异性，在 原核细胞中能获得了成功表达，大

40、量表达对细胞没有毒性成功在 E. coLi BL21 体 内得到表达，故使 E. coLi BL21 呈现出黄绿光，在紫光光照射下，呈现强烈绿色。 对于本次综合性实验，所运用的实验条件并没有硬搬一般文献上给定的数 据，如再进一步提纯质粒浓度时（文献中是酚氯仿7，而实验室用的是酚氯） ， 离心的转速（文献是8000rpm7，而试验中统一为10000rpm） 、而使用仅有离心 机不具有是温度保持在要求范围内）等,我们以实验室的现有条件为基础,成功 的构建出了含有绿色荧光蛋白的报告基因。 实验中得到的结果，也存在与理论不一致的地方，如在加入酚氯仿之后， 应该是上层为水层，但实验观察到的下层为水层，此

41、处为避免出错，实验中本 小组上下液层各取了一eppendorf管，并分别进行了后续试验，图七证明了结果 质粒的确在上层的有机层，而不是课本所说在上层水层。由此说明对于参考文 献，我们应该怀有一种批判的心里对待，在实验室要有严谨的科研素养，以实 验为中心，相信实验结果。 6.参考文献 1吴世康. 2009. 绿色荧光蛋白质 ( GFP) 的发现、 表达和发展. 影像科学与光 化学, 27 ( 1) : 69 78 2朱昀 李朝炜(河北科技大学生物科学与工程学院 石家庄) .绿色荧光蛋白 3崔志芳, 邹玉红, 季爱云. 2008 . 绿色荧光蛋白研究的三个里程碑! ! ! 2008 年 诺贝尔化学

42、奖简介. 自然杂志, 30( 6) : 324 328 4 Dr. Robert E. Campbell, University of Alberta, CANADA. Campbell (2008), Scholarpedia, 3(7):5410. 5Novagen.ORDERING 800-526-7319.TECHNICAL SUPPORT 800-207-0144 6陈伟伟, 郭正红, 康升云, 魏兰珍, 王全喜. (上海师范大学 生命与环境科学学 院, 上海 ) . 增强型绿色荧光蛋白在集胞藻 6803 中的表达 7魏春红、李毅现代分子生物学实验技术高等教育出版社，2006:1-44； 鸣谢：很感谢指导老师王友如，给予我精辟的理论和熟谙的实践指导，是 我受益匪浅！同时感谢同学宜佳，丁佐彬友好的合作帮助！