RNA干扰技术PPT演示课件

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1、RNA 干 扰 技 术,RNA干扰：一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,RNA 干扰（RNA interference, RNAi,RNA 干扰的发展简史： 近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被Science杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域,2006年的诺贝尔生理学奖获得者,Andrew Z. Fire Craig C. Mel

2、lo,RNAi- RNA interference,siRNAs-Small interfering RNAs (小干扰性RNA,dsRNA-double strand RNA(双链RNA,RISC-RNA-induced silencing complex (RNA诱导沉默复合物,Dicer- RNAaseIIIrelated enzymes (RNAaseIII家族成员,PTGS-Post-transcriptional gene silencing 转录后基因沉默,Glossary (术语,RNA干扰,RdRP- RNA-directed RNA polymerase (RNA指导RNA

3、聚合酶,转录后沉默,Post-transcriptional gene silencing (PTGS,RNAi 研 究 史,20多年前，在对矮牵牛花（petunias）进行的研究中发现协同抑制现象cosuppression，导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制,96年前后，研究发现 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1 基因的表达；三年后，首次将双链RNA注入到线虫中,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默效果，这种技术的成熟使得大规模筛选线虫RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能，并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究,在果蝇的研究中同样发现RNA

4、i。通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具，用于鉴定功能缺失表型,2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功,牵牛花（petunias） 协同抑制现象cosuppression,线虫的RNAi,左）两线虫带有含普遍性表达的GFP报告基因重组质粒的 表达品系。 （右）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体GFP 信号消失（头部区域有些神经元对该效应具有抗性,RNAi 应答的基本

5、特征,3、RNAi效应可以在线虫体内传播-即传播效应,1、靶基因内源性序列不发生改变，即RNAi不引起稳定 的遗传改变,2、发现细胞质中靶mRNA水平下降，但细胞核的mRNA前 体数量未受影响。相应原核生物，位于操纵子的基因在 RNAi不发生交叉反应。说明RNAi是在转录后发挥 作用(PTGS),4、每个细胞仅需要少量siRNA分子就可对大量mRNA发挥 作用，提示存在某些放大和/或催化活性的因素在起作用,例如： 依赖RNA的RNA聚合酶 （RdRP）的发现 线虫中的随机降解性PCR模型,RdRP - 依赖RNA的RNA聚合酶,1、多种遗传学实验证实了RdRP在基因沉默中的重要作用, 其活性是

6、基因沉默机制中不可缺少的组分。 （首先在线虫和果蝇中获证,2、果蝇和线虫提取物中的siRNA可以作为RdRP的引物， 可以继续引导产生更多的dsRNA。这个过程成为- 降解PCR （degradative PCR,3、RdRP的功能似是产生以单链RNA引导的dsRNA的合成， 而dsRNA经dicer切割成siRNA，从而放大并维持PTGS 效应,RNA-directed RNA polymerase,RICS,RNA-induced silencing complex,Gene silencing,线虫中的随机降解性PCR模型,哺乳动物细胞中的RNA干扰,大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳

7、动物的成体细胞后，会非特异的阻断基因的表达。这是由于当长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活，会引起非特异的基因表达抑制 。 这种抑制是通过以下两种途径之一进行的,长的dsRNA,研究发现不超过30个碱基的双链RNAs并不会激活PKR激酶途径,哺乳动物细胞中的RNA干扰,通过瞬时转染导入的siRNAs能够以序列专一的方式有效 诱发培养的哺乳动物细胞的RNAi,siRNAs的效率各有区别最有效的siRNAs能使靶RNA 和蛋白水平降低90%以上,研究发现最有效的siRNAs是21个碱基大小、3端有两个 突出碱基的双链RNA,siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRN

8、A之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果,Degradation of the target mRNA (引起靶标mRNA的降解), Inhibition of translation of the target mRNA (抑制靶标mRNA的翻译), Silencing the gene transcription from the target promoter (引起靶标启动子的转录沉默,The targets of the RNAi-directed gene silencing （RNA干扰指导的基因沉默的结果,Dicer: an RNaseIII-like multidomai

9、n ribonuclease that first processes input dsRNA into small fragments called short interfering RNAs (siRNAs) or microRNAs (miRNA). Dicer then helps load its small RNA products into RISC. RISC (RNA induced silencing complexes) (RNA诱导的沉默复合物): a large multiprotein complex that direct the bound siRNA or

10、miRNA to its target and inhibit the target gene expression,The heart of the RNAi mechanism RNAi 机制的核心是,RNAi 机制 模式图,在起始步骤，加入的dsRNA被Dicer酶切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段,在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, or RISC,激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程,并在

11、距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA,确定目的基因 根据相对应的核酸序列设计出 siRNA的序列 获得siRNA 用siRNA转染细胞 分析RNA干扰的效果,RNA干扰研究的一般流程,siRNA的一般结构： 哺乳动物：21-23bp dsRNA 非哺乳动物：长片段dsRNA,siRNA的设计I,如何选择siRNA靶位点,siRNA的设计II,2、研究结果显示GC含量在30%50%左右的siRNA要 比那些GC含量偏高的更为有效,1、从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列， 记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的 siRNA靶位点,3、在设计siRNA时不要针对5和3

12、端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响RISC结合mRNA,从而影响siRNA的干扰效果,序列同源性分析,将siRNA序列和相应的基因组数据库（人，或者小 鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列 / EST同源的序列。例如进行BLAST搜索分析（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST,选出合适的目标序列进行合成,并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA,设

13、计阴性对照,通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查 结果以保证它和其他基因没有同源性。或者用housekeeping genes 作对照,补充,Whitehead 研究所已研发了siRNA的自动选择方法，并于 网站：http:/jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA/home.php 上向公 众开放这个软件允许使用者定义序列基序和G/C含量， 并自动在人和鼠的基因组数据库中搜索siRNA序列，以 防错配,疑难解答,假如siRNA不起作用，应首先确定所使用的靶序列和细胞是 否来源于相同的组织。是否使用了错误的细胞系。 应确定用于进行RNAi的siRNA双链对选择的mRN

14、A序列是否 可靠的，因后者可能包含序列上的错误、突变（如在癌细胞 中）或存在多态性,http:/,双链 RNA合成 非特异siRNA合成,siRNA的合成,siRNA construction procedure,引导序列,T7启动引物,DuraScribe T7 Transcription Kit,通过高效的体外转录合成siRNA,使用了特殊的T7 RNA 聚合酶，可以2-F-UTP 和 2-F-CTP为底物，生成带有氟修饰的RNA- DuraScribe RNA,这种带有修饰的RNA可以很好的抵抗RNase A 双链的DuraScribe RNA可以被RNase III 消化。 DuraS

15、cribe RNA不需要转染试剂就可进入细胞，并且无需去除血清。 双链oligo DNA, 线形质粒，PCR产物都可以用作转录模板,产量，50ug/20ul,Inhibition of HIV-1 Infection by Small Interfering RNA-Mediated RNA Interference1 John Capodici*, Katalin Karik and Drew Weissman2,* The Journal of Immunology, 2002, 169: 5196-5201,非特异性siRNA合成 -ShortCut RNAi Kit,大肠杆菌RNase

16、 III是一种识别双链 RNA的内切酶，产物为 3端外悬2-3个碱基的双链短片段，与 Dicer在真核生物RNAi途径中相同。利用RNase III 消化得到的siRNA混合物直接转染细胞，通常能够保证目的基因被有效地抑制,用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA,Figure 2: siRNA production by ShortCut RNase III: (A) Varying amounts of ShortCut RNase III were incubated with 2 g of a 500 bp dsRNA for 20 minutes. (B)dsRNA

17、fragments (1 kb and 175 bp) were digested with ShortCut RNase III. Digestswere analyzed by 20% TBE polyacrylamide gel electrophoresis,Figure 3: GFP Silencing in COS-7 Cells: COS-7 cells co-transfected with a plasmid expressing GFP in the absence (control) or the presence of 30ng (4 nM) of GFP siRNA

18、prepared using the ShortCut RNAi Kit. Cells were photographed 48hours post-transfection,siRNA表达载体在细胞中表达siRNAs 以PCR制备的siRNA表达框进行体内转录 利用病毒系统实现体内表达siRNA,体内转录合成 siRNA,优点：不需要直接操作RNA,siRNA表达载体,BD Knockout RNAi vectors,The DNA vector-based RNA interference (RNAi) technology,BD Knockout Adenoviral RNAi Syst

19、ems,BD Knockout Adenoviral RNAi Systems 系统能快速、方便的形成表达发夹结构的siRNA的重组腺病毒，从而有效的侵染到各种宿主细胞。 BD Knockout Adenoviral RNAi System 1使用RNAi-ready pSIREN Shuttle vector，通过酶切连接构建腺病毒DNA质粒。可感染分裂及非分裂细胞，宿主细胞范围广，可实现高水平表达。能感染难以转染的细胞,siRNA表达载体,pSIREN 载体分为两种：pSIREN-Shuttle和pSIREN-RetroQ。pSIREN 载体带有U6启动子，均为线性载体，pSIREN-Re

20、troQ载体带有真核筛选标记-嘌呤霉素抗性基因 pSIREN-Shuttle可以进一步应用于构建腺病毒载体； pSIREN-RetroQ可以进一步应用于构建逆转录病毒载体，应用于感染难以转染的细胞,BD Knockout RNAi vectors,Luciferase,b-actin,1 2 3 1 2 3 1 2 3,1 2 3 1 2 3 1 2 3,pSIREN-Shuttle,pSIREN-DNR,pSIREN-Retro Q,1: CMV-Luc only 2: + aLuc shRNA 3: + Neg control,pSIREN vectors: Dual Plasmid- a

21、nd Viral-based shRNA Vectors,n=3,siRNA表达框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中,siRNA表达框进行体内转录,表达框架包括,一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,优点：SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。SECs成为筛选siRNA最有效工具,缺点：PCR产物难以转染入细胞、不适合大规模制备,总结5种不同的制备siRNA的方法,Nitrite amount,i

22、NOS,SiRNA 的 转 染,RNAiFect Transfection Reagent siRNA 转染专用试剂，使用简单,转染方法： 1 磷酸钙共沉淀; 2 电穿孔法; 3 DEAE-葡聚糖 4 机械法 5 阳离子脂质体试剂,注意事项： 1 纯化 siRNA ； 2 避免RNA酶污染 3 细胞培养和操作严格 4 避免使用抗菌素 5 选择合适的转染试剂 6 合适的阳性对照 7 通过标记siRNA来优化实验,Fig 3. Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA (in situ hybridizat

23、ion in embryos) (胚胎的原位杂交,adult body wall at high magnification (高放大倍数的 成虫体壁,No hybridization and staining,hybridization (endogenous mex-3 RNA,antisense +hybridization,ds mex-3 RNA +hybridization,RNAi的应用,一、研究基因功能,二、研究信号传导通路,三、基因治疗,MicroRNAs,MicroRNA (miRNA): A New Class of Small RNA Molecules,siRNA小干

24、扰RNA stRNA- 小时序RNA miRNA- microRNA It appears that “ tiny RNA world” may not be so tiny after all,miRNAs的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。 miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005,What is miRNAs,miRNAs具有稳定的特异性序列以调节基因表达。2001年，miRNAs作为线虫生长发育过程中的调节器而被发现，在病毒、植物和动物体中，miRNAs已被公认为主要的调控基因家族之一，通

25、过mRNA靶向作用降解或抑制其翻译,What is miRNAs,1、miRNAs是一种1825nt长的单链小分子RNA,广泛存 在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA， 它本身不具有开放阅读框（ORF,miRNAs 的特点,2、成熟的miRNAs，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大 小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，成熟的 miRNAs 5-端的磷酸基团和3-端羟基是它与相同长度的 功能RNA降解片段的区分标志,3、miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种 形式存在于基因中。70%90% 位于基因间隔区， 其余在内含子，极少数在蛋白编码区,参阅：“中国生物化学

26、与分子生物学报”2010，26：1,与siRNA的比较,4、miRNA不仅在结构上保守，而且在物种间具有高度 的进化保守。（5端的28个核苷酸有一定保守性,5、miRNA具有明显的时空特异性及组织特异性。目前 研究较清楚的 lin-4与lin-7呈时间特异性表达；miR-1 在肌肉组织中特异表达，并且调控肌肉组织的生长、 分化,1、共同之处：长度（22nt）；依赖Diser酶加工；由双 链RNA或RNA前体形成；都形成RISC；作用方式相同,参阅：“中国生物化学与分子生物学报”2010，26：1,2、miRNA和siRNA的差异： 来源区别： miRNA-内源； siRNA-外源 结构区别：m

27、iRNA-前体miRNA折叠发夹结构 siRNA-完全互补的双链切断，也可发夹结构 作用位点：miRNA-靶基因3-UTR区、ORF内 siRNA-可设计或改变，mRNA任何部位 作用方式：miRNA-与靶序列互补低，阻止mRNA翻译 siRNA-与靶序列互补高，助于mRNA降解 功能区别：miRNA-调节生物体的生命过程（生长、发育 代谢、应激、凋亡等等） siRNA-生物体抵抗外来核酸侵入的意义,参阅：“中国生物化学与分子生物学报”2010，26：1,siRNA 与miRNA的比较,miRNAs 作用 原 理,转运蛋白,siRNA,RNA聚合酶II转录miRNA初产物,miRNA 的作用方

28、式,1、负向调节沉默基因表达,1）翻译抑制 (发生在哺乳动物系统) （2）靶基因降解 （发生在植物系统,模式,2、正向调节： （不常见,例如：人类肝脏特异表达的miRNA（miR-122），可 结合到肝炎病毒基因组的5-UTR，引起病毒 RNA的剧增，但其机制仍不明,miRNAs的表达调控,RNA聚合酶II催化产生的miRNA有帽子、polyA尾巴 及具有相应的剪接方式。部分miRNA与mRNA一样 也处于转录因子的控制下，并受内外环境影响,转录因子“缺氧诱导因子（hypoxia induce fector HIF) 参与调控40%-50% miRNA的启动子,例如：目前研究热点,参阅：“中国

29、生物化学与分子生物学报”2010，26：1,预测：人类基因组，约30%mRNA有miRNA 参与其调控； 人类已有600多种miRNA被鉴定（参阅 httpa:/microrna.sanger.ac.uk），且每个 miRNA可结合多个靶mRNA,参阅：“中国生物化学与分子生物学报”2010，26：1,RNAi技术的应用展望,基因功能研究 蛋白表达调控，信号传导通路，发育过程 基因治疗及药物筛选探索 治疗细胞异常增殖相关的疾病，抗病毒治疗 药物靶位点鉴定 制备功能缺失表型,一 外源RNA诱导RNAi的应用,二、待解决的问题,1, 短干扰性RNA(siRNA)指导基因沉默到达靶序列,但它 对转录

30、组和基因组是如何起效应的? 2, RNA 介导沉默复合物中哪种蛋白质与siRNA发生作用, 哪 种成分是催化和功能性的核心? 3, siRNA生成是Dicer酶的作用,但Dicer如何受到调节,如何识别 不同结构的dsRNA底物,如何促使siRNA形成效应复合物,展望,作为实验工具使生物学研究发生革命性变化 siRNA 文库的建立,将能快速高效地研究几乎每一个决定特异 生物学表型的基因的功能. 作为传统遗传学工具的补充,提供更快速高效的方法以减少 成活动物的亚效等位基因突变效应 实现RNA干扰作为分析和构建疾病模型的工具向疾病治疗 工具的转变等,三 内源RNAi机制及功能研究,1. 抗病毒功能

31、,2. 基因调控,3. 染色质浓缩,4. 转座子沉默,5. 基因组重组,Thank you,寡腺苷酸合成酶,获得RNAi生物化学通路的大致过程,1、检测RNAi 每一步的ATP依赖性 2、使用通路中的中间物启动RNAi 3、用经典的生化分级分离方法分离RNAi所需的蛋白 酶和蛋白-RNA复合物 4、将通路分割成若干个部分，最终提示出RNAi的关 键步骤,RNAi的关键步骤,体外实验证实,2、长的dsRNA进入果蝇胚胎中即被剪切成含21-23 个 核苷酸的小的干扰性RNA（siRNA,3、siRAN是RNAi通路的真正中间体，它能指导 RISC 破坏靶 mRNA,4、siRNA指导的RISC能指

32、导核酸内切酶切割RNA分子 中的某一磷酸二酯键，而该磷酸二酯键在靶分子上 的位置可根据siRAN 来确定,1、dsRNA确实能识别并破坏相应的mRNA。无细胞 抽提物研究表明，RISC相关活性能完全破坏mRNA 分子,线虫中的随机降解性PCR模型,由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，细胞内存在RNAi效应的扩增系统,真核细胞中存在能以RNA-指导的 RNA 聚合酶， （RNA-directed RNA polymerase，RdRP,在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA,通过Dcier形成siRNA, siRNA可以作为RdRP的引物, 通过类似PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增, 产生siRNA。即降解性PCR (degradative PCR